甘藍(lán)型油菜GPAT6基因啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

胡學(xué)芳，劉 聰，肖旦望，熊興華，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)／作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物所，長(zhǎng)沙410128）

甘藍(lán)型油菜GPAT6基因啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

胡學(xué)芳1，劉 聰1，肖旦望1，熊興華1，2*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)／作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料作物所，長(zhǎng)沙410128）

通過同源PCR克隆的方法，首次從甘藍(lán)型油菜中克隆了甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6，GPAT6）基因長(zhǎng)1 110 bp的啟動(dòng)子，并將其成功構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121上。重組載體可用于轉(zhuǎn)化擬南芥，探究甘藍(lán)型油菜GPAT6基因的組織表達(dá)特征。

甘藍(lán)型油菜；GPAT6基因；啟動(dòng)子；基因克隆；表達(dá)載體構(gòu)建

甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶是三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）生物合成的關(guān)鍵酶之一［1］，催化TAG生物合成的起始步驟。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)10個(gè)GPAT基因家族成員［2］，分別命名為ATS1、AtGPAT1、AtGPAT2、AtGPAT3、AtGPAT4、AtGPAT5、AtGPAT6、AtGPAT7、AtGPAT8和AtGPAT9。各成員的定位不同，分別定位于質(zhì)體GPAT（ATS1）［3］、線粒體GPAT（AtGPAT1／2／3）［4］和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)GPAT（AtGPAT4／5／6／7／8／9）［2，5］。ATS1主要將?；鶑腶cyl-ACP轉(zhuǎn)移到G-3-P的sn-1位置上形成溶血磷脂酸（Lysophosphatidic acid，LPA）［6～8］，而家族中其他成員則以acyl-CoA為?；w［6］。陸生植物特異性GPAT（EC2.3.1.198）能將酰基轉(zhuǎn)移到甘油-3-磷酸的sn-2位上，形成sn-2單酰甘油（sn-2-Monoacylglycerol，sn-2 MAG）［4，9］。溶血磷脂酸在溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶的作用下得到第二個(gè)?；?，形成磷脂酸（Phosphatidic acid，PA）［10］。PA在磷脂酸磷酸酶的作用下，脫去磷酸基團(tuán)形成二酰甘油（Diacylglycerol，DAG），經(jīng)二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（Diacylglycerol acyltransferase，DGAT）的催化作用產(chǎn)生TAG［11］。

TAG是植物種子儲(chǔ)存脂的主要成分。Jain等［12］將紅花質(zhì)體GPAT基因（CtpGPAT）轉(zhuǎn)入擬南芥中超表達(dá)，使其種子含油量提高了15%。Gidda等［5］對(duì)擬南芥AtGPAT9編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，推測(cè)其與擬南芥種子含油量有關(guān)。此外，GPAT基因家族的功能已在多種植物中展開。有研究證明，擬南芥［3］、菠菜（Spinacia oleracea）［13，14］、豌豆（Pisum sativum）［13，15］等質(zhì)體GPAT酶對(duì)順9-十八碳烯酸（油酸）的親和力比較強(qiáng)［16］。抗低溫能力弱的植物如南瓜（Cucurbita moschata）質(zhì)體GPAT酶偏好于飽和脂肪酸［14］。Yan等［17］將甜椒的GPAT基因轉(zhuǎn)入煙草中超表達(dá)，提高了煙草耐高溫能力。Li等［18］發(fā)現(xiàn)，擬南芥gpat5突變體的幼根和種皮中軟木脂的含量下降，種子萌發(fā)和幼苗成活率顯著降低。擬南芥atgpat4／8雙突變體的莖和葉中表現(xiàn)出明顯的幾丁質(zhì)缺陷［18］，atgpat6突變體的花瓣表現(xiàn)出幾丁質(zhì)缺陷［19］。甘藍(lán)型油菜BnGPAT4干擾系葉片角質(zhì)層有明顯幾丁質(zhì)缺陷，氣孔不能正常關(guān)閉，使植株長(zhǎng)期處于高蒸騰作用狀態(tài)，容易失水［20］。

油菜是重要的油料作物，在我國(guó)具有悠久的栽培歷史。目前我國(guó)面臨對(duì)食用油需求的日益增加和全球氣候變化帶來的干旱、鹽堿地面積擴(kuò)大等問題，如何提高油菜的抗逆性對(duì)提高我國(guó)油菜單產(chǎn)具有重要意義。研究表明，甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶家族與作物的育性［21，22］、種子含油量［12］和抗逆性［17，18，20，23，24］相關(guān)。其中擬南芥AtGPAT6與結(jié)實(shí)率有關(guān)。在花藥發(fā)育階段，擬南芥AtGPAT6在絨氈層和小孢子中大量表達(dá)。在本試驗(yàn)之前筆者已經(jīng)克隆了甘藍(lán)型油菜GPAT6基因的CDS序列。組織特異性表達(dá)及逆境脅迫表明，BnGPAT6基因表達(dá)豐度在油菜花中最高，受干旱、高鹽以及植物激素的影響。本研究通過同源克隆的方法獲得其啟動(dòng)子，并構(gòu)建植物表達(dá)載體，以為揭示GPAT6基因在油菜中的表達(dá)特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘藍(lán)型油菜湘油15號(hào)；TransGen生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒、TransTaq DNA Polymerase High Fidelity DNA聚合酶套裝、10 mmol／L dNTPs、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、Hin dIII和Bam HI核酸內(nèi)切酶以及T4DNA連接酶；TaKaRa生物有限公司的pMD18-T載體；植物表達(dá)載體pBI121。其他試劑均為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油菜DNA提取

用TransGen生物技術(shù)有限公司DNA提取試劑盒提取湘油15號(hào)幼葉DNA，試驗(yàn)步驟參照試劑盒說明書。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

用油菜BnGPAT6（KC106728）基因的序列在白菜基因組序列中查找同源基因，根據(jù)BnGPAT6基因設(shè)計(jì)基因特異性引物BnGPAT6RS：CGTGGACTAGCTGTTACTATAT，根據(jù)白菜GPAT6基因的上游序列設(shè)計(jì)PCR上游引物Bra017137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下劃線處為Hin d III酶切位點(diǎn)）和Bra005137F： CCCAAGCTTTAACACTTGTGCTGCTATGTCC（下劃線處為Hin d III酶切位點(diǎn)）。BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3 啟動(dòng)子克隆

以油菜基因組DNA為模板，用BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系20μL：5 U／μL DNA聚合酶0.4μL，10 mmol／L dNTPs 0.4μL，10×PCR緩沖液2μL，50 ng／μL模板2μL，2μmol／L正反引物各2μL，ddH2O 11.2μL。PCR程序：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸90 s，72℃保溫8 min，16℃恒溫。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）檢測(cè)和記錄結(jié)果。將PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆送往華大基因測(cè)序，并提取測(cè)序成功菌落的質(zhì)粒。質(zhì)粒提取方法參照質(zhì)粒提取試劑盒。

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建

用MEGA5.0將啟動(dòng)子序列與白菜GPAT6基因的上游序列及甘藍(lán)型油菜GPAT6基因序列進(jìn)行比對(duì)，確定目的序列為BnGPAT6基因啟動(dòng)子序列后，根據(jù)其設(shè)計(jì)下游-引物BnGPAT6RB：CGCGGATCCACAAGAAGAGAAGAGAGAGAGC（下劃線處為BamH I酶切位點(diǎn)），以含有目的序列的質(zhì)粒為模板，用引物Bra017137F與BnGPAT6RB進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳純化后，切膠回收。用Hin d III和Bam HI核酸內(nèi)切酶對(duì)目的片段和pBI121質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：DNA 10μL、10×K buffer 2μL、Hin d III和Bam HI核酸內(nèi)切酶各1μL、ddH2O 6μL。將反應(yīng)體系置于PCR儀中37℃反應(yīng)4 h。酶切結(jié)束后用2%的瓊脂糖凝膠電泳純化反應(yīng)產(chǎn)物，并回收。用T4連接酶將目的片段連接到切好的pBI載體上。連接體系20μL：載體DNA1μL、目的片段3μL、T4 DNA連接酶1 μL、5×連接緩沖液4μL、ddH2O 11μL。16℃反應(yīng)12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取抗性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。提取菌落PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子的克隆

用BnGPAT6RS分別與Bra017137F和Bra005137配對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，BnGPAT6RS與Bra017137擴(kuò)增出1 500 bp左右的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符。

圖1 PCR產(chǎn)物

將PCR產(chǎn)物回收后與T-vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，目的片段3′-端411個(gè)堿基（基因起始密碼子及其下游序列）與BnGPAT6基因序列完全一致，5′-端1 110個(gè)堿基與白菜Bra017137基因上游序列相似度很高，表明克隆了長(zhǎng)度為1 110 bp的BnGPAT6基因啟動(dòng)子。

圖2 BnGPAT6基因啟動(dòng)子序列

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以含有目的片段的T載體為模板，用引物Bra017137F與BnGPAT6RB進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收后進(jìn)行雙酶切，然后用T4連接酶將目的片段連接到植物表達(dá)載體pBI121上（圖3），轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。挑取抗性菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖4），提取PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢測(cè)（圖5）。檢測(cè)結(jié)果表明，BnGPAT6基因啟動(dòng)子成功替換pBI121上的CaMV 35S啟動(dòng)子（圖3）。

圖3 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)

圖4 菌落PCR檢測(cè)

圖5 雙酶切檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過同源PCR克隆的方法，克隆了油菜GPAT6基因的啟動(dòng)子，并成功構(gòu)建到pBI121載體上。

同源克隆是一種比較簡(jiǎn)單可行的基因克隆方法。本試驗(yàn)通過已經(jīng)公布的甘藍(lán)型油菜BnGPAT6基因序列和白菜基因組序列設(shè)計(jì)引物，通過PCR成功克隆BnGPAT6基因的啟動(dòng)子，并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121上。目前外源基因?qū)胫参锏姆椒ǘ嗖捎棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)法，這就需要將外源目的基因整合在植物表達(dá)載體中。目前使用較多的植物表達(dá)載體是雙元表達(dá)載體，如pBI121、pCAMBIA系列。由于酶切位點(diǎn)的選取限制，本研究選取了pBI121作為表達(dá)載體。此外，pBI121載體具有GUS基因，其表達(dá)產(chǎn)物既不會(huì)影響植物生長(zhǎng)，也不會(huì)轉(zhuǎn)移。因此，用油菜BnGPAT6基因啟動(dòng)子替換pBI121載體上的CaMV 35S啟動(dòng)子，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入植物中表達(dá)，經(jīng)染色后，能直觀地看到BnGPAT6基因啟動(dòng)子的活性及BnGPAT6基因的表達(dá)特征。

然而，油菜是異源四倍體植物，在油菜體細(xì)胞中，每個(gè)基因可能存在多個(gè)拷貝。目前已經(jīng)公布了油菜BnGPAT6基因的兩個(gè)（KC106728、KJ000117）拷貝，因此，本試驗(yàn)中克隆得到的啟動(dòng)子只是多個(gè)拷貝中的1個(gè)，其表達(dá)活性只能體現(xiàn)KC106728的表達(dá)特征。因此，要了解BnGPAT6基因的表達(dá)特征，還需弄清油菜中GPAT6基因的拷貝數(shù)并獲得其啟動(dòng)子，或借助其他的方法做進(jìn)一步的研究。

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Cloning and Expression Vector Construction of GPAT6 Gene Promoter in Brassica napus

HU Xue-fang1，LIU Cong1，XIAO Dan-wang1，XIONG Xing-hua1，2*
（1 Hunan Agricultural University／Crop Gene Engineering Key Laboratory of Hunan Province，Changsha，Hunan 410128，China；2 Oilseed Crops Institute，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

In this study，the promoter，1 110 bp in length，of GPAT6 gene was cloned from B.napus at the first time by homology-based PCR cloning，and then itwas constructed to plant expression vector pBI121.The recombinant vector could be transformed into Arabidopsis thaliana to study the tissue expression pattern of GPAT6 gene in B.napus.

Brassica napus；GPAT6 gene；Promoter；Gene cloning；Expression vector construction

Q78；S565.401

A

1001-5280（2014）05-0467-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.05.04

2014 04 16

胡學(xué)芳（1989-），女，湖南婁底人，碩士研究生，Email：472209985＠qq.com。*通信作者：熊興華，博士，副教授，Email：xionggene＠yahoo.com。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（“863”計(jì)劃）項(xiàng)目（2012AA101107-3）；湖南省科技廳項(xiàng)目（06FJ4264，07RS4014）。