精神分裂癥患者血漿miRNA表達(dá)水平與精神癥狀的關(guān)系研究

宋紅濤，過偉，孫欣羊，張梁，趙林，鐘愛芳，牛威，戴運(yùn)華，張理義，盧正斌

miRNA是一類長(zhǎng)度在22nt左右，能夠調(diào)控編碼區(qū)蛋白表達(dá)水平的內(nèi)源性小分子RNA[1]。miRNA通過與目標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致目標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制：當(dāng)miRNA與mRNA不完全互補(bǔ)時(shí)，將導(dǎo)致翻譯抑制；當(dāng)miRNA與mRNA完全互補(bǔ)時(shí)，則導(dǎo)致目標(biāo)mRNA降解[2]。單個(gè)miRNA分子能夠調(diào)節(jié)幾百個(gè)基因位點(diǎn)，而miRNA的整體網(wǎng)絡(luò)則可調(diào)節(jié)50%～60%的轉(zhuǎn)錄過程[3]。miRNA憑借其在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，在機(jī)體生物信息網(wǎng)絡(luò)中扮演著重要角色，與多種精神疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[4]。病例對(duì)照研究證實(shí)，精神分裂癥患者體內(nèi)存在多種miRNA的表達(dá)異常[5]，miRNA調(diào)控多種精神分裂癥的易感基因，與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展存在明顯關(guān)聯(lián)[6]。目前精神疾病的診斷主要以癥狀學(xué)為標(biāo)準(zhǔn)，精神分裂癥患者血漿中miRNA的表達(dá)水平與其精神癥狀的相關(guān)性鮮見報(bào)道。本研究在詳細(xì)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)(miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，如TargetScan、miRanda、miRbase等)，選擇9種在精神分裂癥患者體內(nèi)差異表達(dá)顯著的miRNA(miR-30e、miR-34a、miR-181b、miR-195、miR-346、miR-432、miR-7、miR-132、miR-212)進(jìn)行分析，探討其與精神癥狀的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年7月－2013年5月解放軍102醫(yī)院精神科門診收治的精神分裂癥患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版(DSM-Ⅳ)精神分裂癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；②首發(fā)病例或入組前3個(gè)月未服用抗精神病藥物；③年齡15～60歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有其他精神疾??；②患有腦外傷等軀體或神經(jīng)系統(tǒng)疾病；③有酗酒或藥物濫用史；④入組前1個(gè)月內(nèi)有輸血史；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)使用過無抽搐電休克治療(MECT)。共入組53例患者，其中男28例，女25例，年齡15～56(27.5±10.8)歲。本研究獲得解放軍102醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者或受試家屬(監(jiān)護(hù)人)均簽署知情同意書。

1.2 陽性和陰性癥狀量表(PANSS)[7]評(píng)估 PANSS由陽性量表7項(xiàng)(P1-P7)、陰性量表7項(xiàng)(N1-N7)和一般精神病理量表16項(xiàng)(G1-G16)，附加3個(gè)評(píng)定攻擊危險(xiǎn)性的補(bǔ)充項(xiàng)目(S1-S3)組成，包括反應(yīng)缺乏、思維障礙、激活性、偏執(zhí)、抑郁和補(bǔ)充(攻擊性)6個(gè)癥狀群。每個(gè)項(xiàng)目按其精神病理水平遞增的7級(jí)評(píng)分為：1-無，2-很輕，3-輕度，4-中度，5-偏重，6-重度，7-極重度。

1.3 主要試劑及儀器 miRNeasy血清/血漿提取試劑盒、miRNeasy血清/血漿外參(德國(guó)Qiagen公司)；TaqMan MicroRNA Assays、TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ、TaqMan MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)ABI公司)。ABI 9700型PCR儀、ABI 7900HT Fast Read-Time PCR System(美國(guó)ABI公司)；天美CT14RD型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司)；NanoDrop1000超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；WH-2微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；JS-400A恒溫金屬浴(上海培清科技有限公司)；DK-8D數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇凈凈化設(shè)備有限公司)；－80℃超低溫冰箱(日本三洋公司)；Eppendorf移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；Andy Bio掌上離心機(jī)(美國(guó)Andy Bio公司)。

1.4 總RNA抽提與熒光定量PCR反應(yīng) 所有被試者均于用藥前使用EDTA抗凝管采集肘靜脈血5ml，室溫下(15～20℃)離心，將取得的血漿置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照miRNeasy血漿提取試劑盒說明書從血漿中提取總RNA，為了避免抽提步驟導(dǎo)致RNA的含量誤差，加入miR-39血漿外參試劑盒進(jìn)行校正[8-9]。依照TaqMan microRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，按照TaqMan通用混合試劑盒Ⅱ說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，通過ABI 7900型PCR儀測(cè)定Ct值，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)2次。以miRNA與外參miR-39[8-9]之間Ct值的差值(ΔCt)表示miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Pearson相關(guān)分析、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、多元逐步回歸分析miRNA和精神癥狀的關(guān)系，所有統(tǒng)計(jì)分析均為雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 精神分裂癥患者血漿中miRNA表達(dá)水平與各癥狀群及量表總分的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，miR-346的表達(dá)水平與一般精神病理總分呈顯著負(fù)相關(guān)(r=–0.282，P＜0.05)；miR-34a的表達(dá)水平與激活性癥狀群和攻擊性癥狀群呈顯著負(fù)相關(guān)(r=–0.345，r=–0.284，P＜0.05)，余miRNA表達(dá)水平與各癥狀群及量表總分無明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

2.2 miR-34a和miR-346高表達(dá)組、低表達(dá)組各癥狀群及量表總分比較 求出研究對(duì)象miR-34a和miR-346表達(dá)水平的四分位數(shù)，將miR-34a和miR-346的表達(dá)水平低于或等于第一四分位數(shù)(QL=P25)者分別歸為miR-34a、miR-346低表達(dá)組，高于或等于第三四分位數(shù)(QU=P75)者分別歸為miR-34a、miR-346高表達(dá)組，對(duì)高表達(dá)組和低表達(dá)組的各癥狀群及量表總分進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，miR-34a高表達(dá)組的激活性癥狀群和攻擊性癥狀群分值低于低表達(dá)組，miR-346高表達(dá)組反應(yīng)缺乏癥狀群分值低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 miRNA對(duì)精神癥狀群影響的逐步回歸分析以miRNA表達(dá)水平為自變量，以一般精神病理總分、反應(yīng)缺乏癥狀群、激活性癥狀群和攻擊性癥狀群為因變量進(jìn)行逐步回歸分析(自變量選入標(biāo)準(zhǔn)為0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為0.10)，結(jié)果顯示，miR-346進(jìn)入以一般精神病理為因變量的回歸方程，可解釋一般精神病理變異的6.1%，miR-34a分別進(jìn)入以激活性癥狀群和攻擊性癥狀群為因變量的回歸方程，分別可解釋激活性癥狀變異的10.2%、攻擊性癥狀群變異的6.3%(表2)。

表1 miR-34a和miR-346高表達(dá)組、低表達(dá)組各癥狀群及量表總分比較的(n=13)Tab. 1Comparison of syndrome scores and total score in miR-34a and miR-346high- and low-expression groups (n=13)

表2 miRNA對(duì)精神癥狀群影響的逐步回歸分析Tab. 2Stepwise regression analysis of the effects of miRNA expression on mental syndromes

3 討 論

迄今為止，研究者相繼在植物、動(dòng)物和微生物中發(fā)現(xiàn)了大量的miRNA分子，并且數(shù)量在不斷更新。據(jù)計(jì)算機(jī)推測(cè)，人類基因組可能存在1000多個(gè)miRNA基因，單個(gè)miRNA可調(diào)控200多個(gè)靶基因，miRNA對(duì)60%以上的基因起調(diào)控作用，在轉(zhuǎn)錄后水平能夠精確調(diào)控30%以上蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)[10]，這使得miRNA成為最大的一類基因表達(dá)調(diào)控因子。miRNA具有較強(qiáng)的發(fā)育時(shí)序特異性和組織特異性[11-12]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和神經(jīng)元的分化過程中起著十分重要的作用[13-15]。miRNA不僅參與多種神經(jīng)功能的調(diào)節(jié)[16]，還與突觸可塑性有關(guān)[17]。在腦皮質(zhì)發(fā)育時(shí)，一些miRNA的表達(dá)會(huì)隨著皮質(zhì)形成過程中的細(xì)胞增殖、區(qū)域性分化和傳導(dǎo)通路的建立而發(fā)生變化[18]，對(duì)大腦的發(fā)育和功能調(diào)節(jié)起至關(guān)重要的作用[19]。

有研究證實(shí)，miRNA的表達(dá)和調(diào)控異常與精神分裂癥的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。Kim等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，精神分裂癥組有7個(gè)miRNA(miR-7、miR-34a、miR-132、miR-132*、miR-154*、miR-212和miR-544)表達(dá)有升高。Lai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者外周血中有7個(gè)miRNA表達(dá)存在異常(hsa-miR-34a、miR-449a、miR-564、miR-548d、miR-572、miR-652上調(diào)，miR-432下調(diào))，其中一部分與精神分裂癥患者的陰性癥狀、神經(jīng)認(rèn)知功能障礙和錯(cuò)配消極表現(xiàn)呈顯著相關(guān)。作為精神疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)的DSM-Ⅳ和CCMD-Ⅲ主要以癥狀學(xué)為診斷依據(jù)，而隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)顯示，精神分裂癥可能與miRNA的表達(dá)異常有關(guān)，但精神分裂癥患者體內(nèi)miRNA的表達(dá)水平與其精神癥狀的關(guān)系卻研究甚少。

文獻(xiàn)報(bào)道，miR-34a可能參與精神分裂癥的發(fā)病過程[20-21]。本研究結(jié)果顯示，miR-34a與精神分裂癥患者的激活性癥狀群及攻擊性癥狀群有明顯關(guān)聯(lián)，血漿miR-34a表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)患者10.2%的激活性癥狀群和6.3%的攻擊性癥狀群，提示miR-34a可能在精神分裂癥患者的激活性癥狀群和攻擊性癥狀群的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。編碼miR-346的基因位于離子型谷氨酸受體Δ1(GRID1)的內(nèi)含子2上，Zhu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，精神分裂癥患者體內(nèi)miR-346和GRID1的表達(dá)量均低于正常對(duì)照者。本研究結(jié)果顯示，miR-346與精神分裂癥患者的一般精神病理癥狀有明顯關(guān)聯(lián)，血漿miR-346表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)患者6.1%的一般精神病理癥狀。

綜上所述，精神分裂癥患者體內(nèi)miRNA表達(dá)異常與精神分裂癥的發(fā)病有明顯關(guān)聯(lián)。精神分裂癥患者血漿中miR-34a的表達(dá)水平與激活性癥狀群和攻擊性癥狀群有明顯關(guān)聯(lián)，miR-346的表達(dá)水平與一般精神病理癥狀有明顯關(guān)聯(lián)。miR-34a和miR-346可能在上述精神癥狀的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

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