快中子對食管癌細胞EC9706的生物效應

杜曉紅，佟 倜，景士偉，武文斌，孫迎春

（1.內蒙古科技大學數(shù)理與生物工程學院，內蒙古 包頭014010；2.吉林大學第二醫(yī)院胸外科，吉林 長春130041；3.東北師范大學物理學院，吉林 長春130024）

中子屬于高線性能量傳遞（Linear Energy Transfer，LET）射線，直接破壞細胞內DNA 分子，同時還破壞細胞其他結構，細胞難于修復，它對細胞殺傷主要是單擊致死性損傷.快中子對抵抗普通放療的乏氧腫瘤細胞也有殺傷作用；其次，快中子相對生物效應比普通X 線作用大3倍，而且對處于分裂周期不同時相的細胞均敏感.超熱中子能量為1eV～10keV，多應用于硼中子俘獲治療（BNCT），熱中子能量低于1eV，可用于皮膚黑色素瘤等淺部腫瘤治療.文獻報道了大量有關中子輻射生物效應及治療腫瘤研究［1－6］.現(xiàn)以我中心自制中子源裝置，經體外實驗初步檢測快中子對EC9706的生物效應，為快中子在治療中的應用及安全性提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 腫瘤細胞株及實驗分組

將凍存于液氮中的人源性食管癌細胞株EC97069（購于中國醫(yī)學科學院腫瘤細胞庫）取出后常規(guī)方法復蘇，培養(yǎng)于含質量分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，在體積分數(shù)為5% CO2的37℃孵箱內培養(yǎng).用質量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的細胞，離心收集后用無菌PBS緩沖液（pH＝7.4）洗滌2次，鏡下計數(shù)，調整細胞濃度至5×104個／mL，以每孔2.5和0.2mL 分別接種于96孔和6孔培養(yǎng)板中，96孔板的最外環(huán)的孔內分別加入0.2mL PBS緩沖液，以減少細胞生長時的邊緣效應.96孔板細胞用于MTT 法檢測細胞活性，分為6組（1個培養(yǎng)板設為1組，每組60個復孔）.6孔板細胞用于流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡和壞死，分為5組（1個培養(yǎng)板設為1組，每組6個復孔）.待細胞貼壁且生長穩(wěn)定后進行快中子照射，照射之后置于37℃恒溫、5%CO2孵箱中，繼續(xù)孵育24h后用于檢測.

1.2 快中子產生與照射場地

采用中子管為快中子發(fā)射源（東北師范大學物理學院自制）.其中子產額為1×108個／s，中子能量為14 MeV.照射場地在距地面5m 深的具有回廊結構的地下中子實驗廳內進行（通過國家輻射實驗室標準檢測）.被照射樣品置于照射場地后，實驗人員在地上操控室里調節(jié)中子發(fā)生控制電路、中子檢測儀和γ射線監(jiān)測儀，控制電路可調節(jié)輻照時間和中子產額，中子監(jiān)測儀和γ射線監(jiān)測儀可監(jiān)測每一瞬時中子劑量和γ射線劑量，所有數(shù)據(jù)通過MCA 收集并存入電腦.照射時將培養(yǎng)板置于中子管發(fā)射端口正下方約2cm 處，同時在發(fā)生器周圍旋轉中子監(jiān)測儀和γ射線監(jiān)測儀用于監(jiān)測輻照的中子劑量及產生的γ射線劑量.

1.3 MTT檢測細胞活性

從培養(yǎng)箱中取出照射24h 后的96 孔細胞培養(yǎng)板，加入20μL／孔MTT 溶液（質量濃度為5mg／mL），培養(yǎng)箱中再孵育4h后終止，吸棄孔內培養(yǎng)基，再加入150μL／孔DMSO，待紫色結晶物完全溶解后，應用酶標儀在490nm 波長下測定其吸光度（即OD 值）.細胞增殖抑制率＝（1－校正后實驗組OD 均值／校正后對照組OD 均值）×100%.

1.4 Hoechst33342／PI雙染檢測細胞凋亡

取出中子輻照后繼續(xù)孵育24h的6孔板細胞，室溫下用0.25%胰蛋白酶消化，收集各組細胞于EP管中，再置于冰塊操作平臺（保持4℃左右），以Hoechst33342與PI染色，避光放置15min，染色后1h內用流式細胞儀（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）檢測其凋亡率與壞死率.Hoechst 33342 的激發(fā)波長為352nm，發(fā)射波長為400～500nm，產生藍色熒光；PI的激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長大于630nm，產生紅色熒光.

1.5 統(tǒng)計學分析

應用統(tǒng)計學軟件SPSS16.0版進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)采用（ˉx±s）表示，各實驗組細胞凋亡率、壞死率進行單因素方差分析（ANOVA）.P＜0.05表示差異，有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 快中子對細胞的抑制呈劑量依賴性

以96孔板最外圍孔OD值為標準進行校正后計算細胞抑制率.MTT方法檢測結果顯示，快中子照射實驗組細胞的生長呈抑制效應，細胞存活量減少，OD 值下降（見表1）.與對照組比較，照射的各實驗組（3min（0.02Gy）～15 min（0.1Gy））細胞增殖抑制率呈劑量依賴趨勢.15 min照射組細胞抑制率為67.4%.

表1 快中子作用后各組細胞OD值（ˉx±s）

2.2 腫瘤細胞的壞死呈劑量依賴性

Hoechst33342／PI熒光雙染的各組細胞進行流式細胞儀檢測計數(shù)，P3區(qū)間為凋亡細胞計數(shù)，P4區(qū)間為壞死細胞計數(shù)（見圖1）.結果表明：細胞凋亡率比較（各治療組與對照組比較），P＜0.01；治療組間比較，細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異；細胞壞死率比較（治療組與對照組比較），P＜0.05；15min（0.1Gy），30min（0.2Gy），45 min（0.3 Gy）組間比較，P＞0.05；15 min（0.1 Gy），30 min（0.2 Gy），45 min（0.3Gy）組分別與60min（0.4Gy）組比較，P＜0.01，認為60min組較其他組的細胞壞死率顯著增加.結果提示與對照組比較，快中子照射后細胞壞死率增加，并且呈劑量依賴趨勢（見表2）.

圖1 不同劑量快中子作用后EC9706流式檢測直方圖

表2 快中子作用后各組EC9706細胞壞死率與凋亡率（ˉx±s）

3 討論

MTT 法與流式細胞儀檢測，證實中子束對人源性食管癌細胞EC9706呈增殖抑制作用，在一定的時間－劑量范圍內呈正相關.表現(xiàn)為照射時間－劑量增加，腫瘤細胞凋亡與壞死比例增加，其中以壞死為主，不同劑量組之間細胞壞死率存在統(tǒng)計學差異.

中子射線屬于高直線能量轉換（Linear energy transfer，LET）射線，具有獨特的放射生物學特性，如較高的相對生物效應、對細胞周期依賴性小、氧增強比值低、癌細胞受照射后潛在致死性損傷和亞致死性損傷難以修復等.中子殺傷腫瘤的機理可能也是主要通過凋亡途徑來實現(xiàn)的.由于中子損傷效應主要由錯誤修復和難以修復的簇集損傷造成［7］，細胞DNA 損傷修復速率減慢，更多的DNA 損傷被固定，以致細胞存活率下降.本文研究證實快中子對人食管癌細胞株EC9706存在體外呈劑量依賴的抑制作用，并且作用機制以致細胞壞死為主，為快中子體內效應研究及臨床應用等提供了一定的理論依據(jù).

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