互葉白千層愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

□王小敏，莫昭展* ，吳 敏

（玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣西 玉林 537000）

互葉白千層愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生

□王小敏，莫昭展* ，吳 敏

（玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣西 玉林 537000）

本文報(bào)導(dǎo)了互葉白千層從無菌種子苗葉片誘導(dǎo)愈傷組織到植株再生的研究結(jié)果.實(shí)驗(yàn)表明：以繼代代數(shù)不同的無菌苗葉片為誘導(dǎo)材料，在MS基本培養(yǎng)基中添加TDZ0.4mg/L+2,4-D0.4mg/L的第五代繼代苗誘導(dǎo)效果較好，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)100%. 在互葉白千層愈傷組織分化階段，在MS基本培養(yǎng)基中，激素組合篩選中以添加6-BA2.0mg/L+IAA2.5mg/L的分化效果較好，分化率高達(dá)94.53%. 在分化苗伸長生根階段，以MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.8mg/L +AC 0.1%的效果較為顯著，苗平均高度9.4cm，苗最壯，根粗且壯.

互葉白千層；愈傷組織；誘導(dǎo)；分化；伸長與生根

互葉白千層的(Melaleuca?ahemifolia)為桃金娘科薄子亞科下的白千層屬互葉白千層低矮灌木樹種[1]，主要分布于馬來西亞、印度尼西亞、意大利、澳大利亞等國家[2]，目前在我國南方部分地區(qū)也有種植.互葉白千層具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從互葉白千層的莖和葉中經(jīng)過水蒸氣蒸餾而得的互葉白千層油具有強(qiáng)力殺菌作用，又具有溫和的辛香，屬天然香料，當(dāng)前在農(nóng)業(yè)殺菌劑、日用衛(wèi)生制品、皮膚保健品、化妝品、食品香料、藥品等行業(yè)中開始廣泛試用[3].

由于互葉白千層的種子多為敗育，發(fā)芽率低，且種間差異大，致使優(yōu)良品種匱乏，制約了精油生產(chǎn)的量的提高[4].本文對互葉白千層植株嫩莖和嫩葉進(jìn)行組織培養(yǎng)試驗(yàn)，可以對互葉白千層組織培養(yǎng)的進(jìn)一步研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料的選取與處理

以MS+6-BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L+KT1.0mg/L為培養(yǎng)基，種子萌發(fā)的無菌苗為第一代苗，以45d為培養(yǎng)周期進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以后每繼代一次為一代.選取經(jīng)種子萌發(fā)、長勢健壯的無菌苗，剪取帶葉及腋芽的莖段，去除頂端優(yōu)勢，以莖段1.5cm左右接種于培養(yǎng)基中，每瓶接入6個(gè)莖段，莖段插入培養(yǎng)基0.3cm深度.將培養(yǎng)好的試管苗，選取長勢旺盛，葉色濃綠寬厚的葉片，在葉柄處剪斷接入到不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接入7片葉子.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)

以MS作為基本培養(yǎng)基，然后根據(jù)不同的培養(yǎng)目的來添加不同的基本培養(yǎng)基和不同種類、濃度的各種激素，培養(yǎng)基的pH為5.6～5.8，光照培養(yǎng)室溫度為24℃～25℃，光照強(qiáng)度1500～2000Lx，光照培養(yǎng)12h/d.

1.2.1 互葉白千層葉片誘導(dǎo)愈傷組織的設(shè)計(jì)

研究以MS為基本培養(yǎng)基，并添加不同濃度的6-BA、2,4-D和TDZ（見表1），分別接入繼代代數(shù)不同的葉片，篩選出對愈傷組織誘導(dǎo)效果較好的配方和最適合作愈傷組織誘導(dǎo)的繼代代數(shù)苗.以上每個(gè)濃度梯度接種8瓶，每瓶接入7片葉子進(jìn)行培養(yǎng)，45d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的誘導(dǎo)率和愈傷組織的生長狀況.

表1 葉片誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基Table1 Media of callus induction from in vitro leaf

1.2.2 葉白千層愈傷組織的分化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA、IAA和2,4-D（見表2），分別接入由不同方法誘導(dǎo)出的愈傷組織，篩選出比較適合愈傷組織分化的配方，和分化效果最好的繼代苗.以上每個(gè)濃度梯度接種8瓶，每瓶接入6團(tuán)1cm2大小的愈傷組織進(jìn)行培養(yǎng)，45d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的分化率和分化苗的生長狀況.

表2 愈傷組織分化培養(yǎng)基Table2 Media of callus differentiation

1.4.3 互葉白千層分化苗的伸長實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究以MS為基本培養(yǎng)基附加0.1%AC，并添加不同濃度的NAA、KT、IBA和6-BA（見表3），分別接入用不同方法誘導(dǎo)出的分化苗.以上每個(gè)濃度梯度接種8瓶，每瓶接入6叢分化苗，每叢2到3株小苗，45d后統(tǒng)計(jì)分化苗的伸長和生根情況.

表3 分化苗伸長生根培養(yǎng)基Table3 Medium of differentiated seedlings elongation and rooting

1.2.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)方法

愈傷組織的長勢是指愈傷組織的緊密適中程度、愈傷組織的褐化程度、愈傷組織的壞死程度、愈傷組織的顏色深淺程度，以+表示，+越多表示各方面越好.

無菌苗的長勢是指分化苗或繼代苗的健壯程度、芽長均勻程度、分化苗的緊密度適中程度、芽葉完整程度，以+表示，+越多表示各方面越好.

試驗(yàn)中的各數(shù)據(jù)均以平均值計(jì)算而得，生長狀況以直接觀察、比較記錄差別.

2 結(jié)果與分析

2.1 互葉白千層葉片愈傷組織的誘導(dǎo)

表4 不同繼代數(shù)幼苗葉片愈傷組織的誘導(dǎo)Table4 Leaf callus induction of different generation subculture seedlings

葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15d后觀察，在添加有TDZ的培養(yǎng)基中接種的葉片邊緣已經(jīng)變厚，已經(jīng)出現(xiàn)少許的愈傷組織，再培養(yǎng)15d，分化率已經(jīng)達(dá)到了50%以上，其中TDZ與2,4-D組合的實(shí)驗(yàn)組中部分已達(dá)到85%以上的誘導(dǎo)率.到45d后統(tǒng)計(jì)分析得出表4的數(shù)據(jù).研究分析各代繼代苗兩因素組合實(shí)驗(yàn)中，添加TDZ的效果較沒有TDZ的效果明顯好很多，誘導(dǎo)率高，且誘導(dǎo)出的愈傷組織長勢也比沒有添加TDZ的好，高濃度的TDZ誘導(dǎo)效果較低濃度的效果好.在6-BA和2,4-D與TDZ的組合中，2,4-D與TDZ組合較6-BA組合實(shí)驗(yàn)效果好.沒有TDZ實(shí)驗(yàn)組中，6-BA與2,4-D的用量比與誘導(dǎo)的效果成正相關(guān).不同繼代代數(shù)苗對愈傷組織誘導(dǎo)效果影響也比較明顯，在用同一種培養(yǎng)基培養(yǎng)中，繼代代數(shù)越多越容易誘導(dǎo)出愈傷組織.

2.2 互葉白千層愈傷組織的分化

表5 不同繼代代數(shù)苗愈傷組織的分化Table5 Callus differentiation of different generation subculture seedlings

愈傷組織在各分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)45d后統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果顯示激素的濃度變化引起的分化率的變化并沒有呈現(xiàn)出一定的規(guī)律.由表5可以看出，IAA（2.5mg/L）和6-BA（2mg/L）對愈傷組織的分化效果最好，分化率分別為第三代87.19%、第四代90.30%、第五代94.53%，分化率雖然不是最高的，但是分化出的苗整齊性、生長情況較之其他給組實(shí)驗(yàn)都好.從不同繼代苗間的差異可以看出，第三代苗的分化率較之其他兩代苗的分化率要低，第三代苗的分化率并沒有達(dá)到90%以上的，而第四、五代苗的分化率多數(shù)達(dá)到了90%以上，而第四、五代苗間比較并沒有很明顯的差別.

2.3 互葉白千層分化苗的伸長與生根

叢生芽接種在伸長生根培養(yǎng)基15d后，分化苗的整體平均高度已經(jīng)可以達(dá)到3.5cm，苗的高度、長勢相對比較整齊，處理間沒有出現(xiàn)比較明顯的生長上的差異，再培養(yǎng)15d后，苗的整體平均高度已經(jīng)達(dá)到了7cm，此時(shí)的苗出現(xiàn)了較大的差異，部分長勢好的苗已經(jīng)達(dá)到了9cm以上，而長勢差的還是在7cm左右且苗較弱，培養(yǎng)到45d統(tǒng)計(jì)分析，從表6可見在誘導(dǎo)時(shí)期和分化期出現(xiàn)的各繼代苗間的差異在伸長期并沒有顯現(xiàn).一定濃度的6-BA（2 mg/L）與較低濃度的NAA（0.1mg/L）對叢生芽伸長和生根作用效果不如與高濃度的NAA（0.8mg/L）作用效果好.一定濃度的6-BA（2 mg/L）與不同濃度的IBA主要體現(xiàn)在生根作用上，隨著IBA濃度的上升，其組合對苗的伸長和生根作用越好.一定濃度的KT（1 mg/L）與NAA和IBA的組合中，其作用效果與6-BA的作用效果并沒明顯的差異，同樣也是高濃度的NAA和IBA對苗的伸長和生根作用比低濃度的作用效果好.

表6 不同繼代代數(shù)分化苗的伸長生根Table6 Elongation and rooting of different generation subculture seedlings

4 討論與結(jié)論

本文報(bào)導(dǎo)了互葉白千層從愈傷組織誘導(dǎo)到植株再生的全過程，主要分為愈傷組織誘導(dǎo)、愈傷組織分化、分化苗伸長與生根三個(gè)階段進(jìn)行.

在愈傷組織芽誘導(dǎo)階段，發(fā)現(xiàn)以添加了TDZ的愈傷組織誘導(dǎo)效果較好，其中TDZ與2,4-D組合誘導(dǎo)效果最好，這主要是TDZ既起到生長素作用，又起到分裂素作用效果有關(guān)[5]，2,4-D對愈傷組織的誘導(dǎo)效果最有效，兩者組合起到了促進(jìn)作用，故而誘導(dǎo)效果最佳.不同繼代代數(shù)無菌苗對誘導(dǎo)愈傷也影響較大，在無菌苗繼代5代內(nèi),代數(shù)越高誘導(dǎo)的效果越好，這可能是因?yàn)橹仓陜?nèi)激素積累的影響.

在愈傷組織的分化階段，不同的激素配比對植物的生長是有差異的，其中最佳的配方是MS+IAA（2.5mg/L）+6-BA（2mg/L）的培養(yǎng)基.而不同繼代代數(shù)誘導(dǎo)的愈傷組織在分化上差異并不是特別明顯，并沒有出現(xiàn)在誘導(dǎo)期那樣因繼代代數(shù)不同而出現(xiàn)明顯的差異，可能是在植物體內(nèi)積累的激素在形成愈傷組織的時(shí)候已經(jīng)開始慢慢地被消耗掉，以至于在分化的時(shí)候不會(huì)出現(xiàn)較明顯的差異.

在分化苗伸長階段，一定濃度的6-BA（2 mg/L）與較低濃度的NAA（0.1mg/L）對叢生芽伸長和生根作用效果不如與高濃度的NAA（0.8mg/L）作用效果好；一定濃度的6-BA（2 mg/L）與不同濃度的IBA主要體現(xiàn)在生根作用上，這可能是因?yàn)镮BA是生根粉的主要成分有關(guān)，可以促進(jìn)植物的生根[6]，隨著IBA濃度的上升，其組合對苗的伸長和生根作用越好.一定濃度的KT（1 mg/L）與NAA和IBA的組合中，其作用效果與6-BA的作用效果無明顯的差異，同樣也是高濃度的NAA和IBA對苗的伸長和生根作用比低濃度的作用效果好.以MS+6-BA2.0（mg/L）+NAA0.8(mg/L)培養(yǎng)基為較佳配方，形成的苗的、壯，苗均高較高，達(dá)9.6cm.由不同代數(shù)苗誘導(dǎo)而成的無菌苗在伸長階段沒有顯示出一定有規(guī)律性的變化，這可能是由于經(jīng)過了脫分化和再分化階段本來積累在植物體內(nèi)的激素已經(jīng)消耗，或是對形成的新苗的生長沒有明顯影響.不同的植物生長調(diào)節(jié)劑的不同配比及不同濃度比例對不同生長階段的植物的作用是不同的，正確的使用生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度比例才能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康模炔恢劣趯?shí)驗(yàn)失敗而浪費(fèi)材料與原料以及人力，也縮短了植物在工廠化的快繁周期. ■

[1]賈芬，黃宇翔，丁舒敏.香料植物互葉白千層的引種栽培及利用研究[J].福建省農(nóng)科院學(xué)報(bào)，1996，11(1)：33-34.

[2]張燕君，古佛政.互葉白千層精油的組分及抗菌作用[J].廣東林業(yè)科技，1998，14(2)：31-34.

[3]李曉林，梁國魯，胡英浩，等.互葉白千層的扦插繁殖試驗(yàn)研究[J].西南園藝，2003，3(1)：16-18.

[4]張梅，幸世林.互葉白千層大棚引種育苗[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2003，(7)：21-22.

[5]徐曉峰，黃學(xué)林.TDZ：一種有效的植物生長調(diào)節(jié)劑[J].植物學(xué)通報(bào)，2003，20(2)：227-237.

[6]王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術(shù)手冊[J]. 金盾出版社，2006.3，42-87.

【責(zé)任編輯 謝文海】

Induction of Callus and Regeneration in Melaleuca alternifolia

WANG Xiao-min，MO Zhao-zhan*，WU Min
(College of Life Science & Technology, Yulin Normal University, Yulin, Guagnxi 537000)

In this study, the callus induction of aseptic seedlings and the plantlet regeneration of Melaleuca alternifolia were reported． The results showed that the optimization callus induction media was MS medium add TDZ0．4 mg/L+2,4-D0．4mg/L used the fifth generation aseptic seedling and the induction rate achieved 100%．In the stage of callus differentiation, the best differential medium was MS medium supplied with 6-BA2．0mg/ L+IAA2．5mg/L and differentiation rate of callus reached 94．53%． The best medium for regenerated plantlets rooting was MS + 6-BA2．0mg/L+NAA0．8mg/L +AC 0．1% and the average of seedling height reached 9．4cm．The seedlings and roots were strongest than those in the other medium．

Melaleuca alternifolia; callus; induction; differentiation; elongation and rooting

Q945.5

A

1004-4671（2014）02-0059-05

2014-01-01

廣西科技攻關(guān)項(xiàng)目（桂科攻0992011-13）。

王小敏（1979～），男，廣西全州人，玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院博士，講師，從事植物分子生物學(xué)教學(xué)研究；*

莫昭展，玉林師范學(xué)院生命科學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院教授，博士，主要從事植物種質(zhì)資源利用的教學(xué)與研究工作，E-mail: mzz19741028@163.com。