nm23-H2抗體對(duì)C 6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化的影響

林 超 艾文兵 熊志云 彭 智 馮定坤 孫 歡

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，湖北宜昌 443000

nm23-H2抗體對(duì)C 6神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化的影響

林 超 艾文兵 熊志云 彭 智 馮定坤 孫 歡

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)外科，湖北宜昌 443000

目的 探討nm23-H2抗體對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量及其磷酸化的影響，并探討其意義。 方法 將C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)后,按加入nm23-H2抗體的濃度分對(duì)照組（0 mg/L）、低濃度組（20 mg/L）和高濃度組（40 mg/L）3組，通過(guò)采用免疫組化、Western法檢測(cè)C6細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化的變化。 結(jié)果Western結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組中，MMP-2表達(dá)量及其磷酸化程度隨nm23-H2抗體濃度的增高呈降低趨勢(shì)，表現(xiàn)為劑量依賴性關(guān)系，3組相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示：對(duì)照組 MMP-2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為（61.60±6.60）%，低濃度組為（31.00±5.94）%，高濃度組為（17.57±6.15）%，3組相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論 nm23-H2對(duì)C6細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化起調(diào)節(jié)作用，使用特異性抗體對(duì)其拮抗后，MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化水平均呈下降趨勢(shì)。

nm23-H2；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；MMP-2

現(xiàn)已研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H2是Rho-GTPases/nm23信號(hào)通路的重要分子，可通過(guò)影響Rho蛋白的活性而干擾細(xì)胞的侵襲[1]；由于上述膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲行為與MMP-2同樣有重要的關(guān)聯(lián)。因此，nm23-H2在細(xì)胞內(nèi)是否可以通過(guò)影響MMP-2而發(fā)揮作用有待進(jìn)一步探索。該研究2014年2—7月間采用不同濃度的nm23-H2抗體處理C6細(xì)胞，觀察其對(duì)MMP-2蛋白的表達(dá)量及其磷酸化的影響，并探討其作用機(jī)制，以期為腦膠質(zhì)瘤的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)自2014年2月開(kāi)始，2014年7月結(jié)束。C6細(xì)胞由華中科技大學(xué)免疫學(xué)教研室提供；nm23-H2抗體；抗MMP-2抗體，HRP-羊抗兔LgG等均購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，纖連蛋白、新生小牛血清及常規(guī)生化試劑、儀器設(shè)備均由三峽大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 大鼠C6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，待其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，調(diào)整細(xì)胞培養(yǎng)濃度為 1×104～1×105/mL，并按 nm23抗體加入的濃度分為對(duì)照組（0 mg/L）、低濃度組（20 mg/L）和高濃度組（40 mg/L）3組。20 h后收集細(xì)胞樣品，并加入0.4 mLRIPA裂解液，取上清備用。

1.2.2 Western Blot法檢測(cè)C6細(xì)胞中MMP-2蛋白 樣品行

SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移于PVDF膜上，常規(guī)封閉液處理2 h，依次加入一抗（抗 MMP-2 抗體 1∶2 000 稀釋，和羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫作用1 h后顯影。Image J軟件檢測(cè)各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin平均光密度比值均數(shù)。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè)C6細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá) 調(diào)整C6細(xì)胞濃度為1×104/mL，依次加入不同濃度的nm23-H2抗體，后依次滴加 MMP-2一抗（1∶200 0）、IgG二抗， 于室溫孵育 1～2h。 后加入SABC試劑，PBS漂洗后DAB顯色，切片在高倍鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Western blotting法檢測(cè) nm23-H2抗體對(duì)C6細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化的影響

如圖1～4所示，不同濃度nm23-H2抗體對(duì)MMP-2的表達(dá)量及磷酸化均有明顯抑制作用，隨著濃度的增加，其對(duì)MMP-2蛋白表達(dá)及磷酸化的抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì)。

圖1 MMP-2蛋白條帶 圖2磷酸化的MMP-2蛋白條帶

圖 3 β-actin 蛋白條帶 圖 4 β-actin 蛋白條帶

圖1、2所示，隨著nm23-H2抗體濃度的升高，MMP-2蛋白表達(dá)量及磷酸化均呈下降趨勢(shì)，圖3、4均為內(nèi)參。注：1為對(duì)照組，2 為低濃度組（20 mg/L），3 為高濃度組（40 mg/L）。

2.2 Image J軟件檢測(cè)各組 MMP-2、磷酸化 MMP-2、β-actin蛋白條帶平均光密度比值均數(shù)

隨nm23-H2處理濃度的增加，MMP-2蛋白及磷酸化MMP-2/β-actin光密度比值呈下降趨勢(shì)，3組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，見(jiàn)表 1。2.3免疫組化法檢測(cè)nm23-H2抗體對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響

表1 各組MMP-2、磷酸化的MMP-2、β-actin條帶平均光密度比值均數(shù)

隨nm23-H2處理濃度的增加，細(xì)胞MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少，且效果與劑量呈正相關(guān)。3組相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05)，見(jiàn)表 2。

表2 經(jīng)不同濃度nm23-H2抗體處理后C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例

3 討論

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，Rho-GTPases/nm23是一種新近發(fā)現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤信號(hào)通路，該通路所涉及的蛋白表達(dá)量與細(xì)胞的惡性程度密切相關(guān)。已證實(shí)，通路中的核心蛋白nm23-H2具有3種酶的活性作用：組氨酸蛋白激酶、二磷酸核苷激酶、3'-5'核酸外切酶活性[2]。對(duì)多個(gè)胞內(nèi)外蛋白存在影響[3]。該結(jié)果顯示，MMP-2表達(dá)量及其磷酸化程度隨nm23-H2抗體濃度的增高呈降低趨勢(shì)，表現(xiàn)為劑量依賴性關(guān)系，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。目前研究認(rèn)為，在眾多腫瘤的惡性生長(zhǎng)過(guò)程中，MMP-2的激活是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。其本身磷酸化的程度直接關(guān)系到蛋白的活性狀態(tài)，與MMP-2部分基團(tuán)的甲基化同等重要[4]。在該研究結(jié)果提示MMP-2可能受nm23-H2上游的干擾和調(diào)控。免疫組化的結(jié)果顯示：對(duì)照組MMP-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為 （61.60±6.60）%， 低濃度組為 （31.00±5.94）%，高濃度組為（17.57±6.15）%，3 組相互比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與Western檢測(cè)結(jié)果基本吻合。國(guó)內(nèi)外其他學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有效抑制nm23-H2活性后，可明顯抑制腫瘤細(xì)胞向周圍組織的侵襲。由于nm23-H2在細(xì)胞內(nèi)的濃度不同，對(duì)腫瘤細(xì)胞中MMP-2的干預(yù)作用自然不同[5]。MMP-2在胞漿升的高表達(dá)往往提示腫瘤可能早期就已侵襲正常組織。其次，在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)微環(huán)境下，隨著MMP-2等蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，不僅可以增強(qiáng)細(xì)胞自身的侵襲性生長(zhǎng)，并可以誘導(dǎo)細(xì)胞基質(zhì)的廣泛破壞，二者之間可以相互作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為[6]。該實(shí)驗(yàn)研究也同樣證明了這一點(diǎn)。

其他學(xué)者通過(guò)免疫組化等方法證實(shí)：nm23-H2與同家族的nm23-H1不同，其關(guān)鍵點(diǎn)在于：nm23-H2可通過(guò)結(jié)合C-myc基因啟動(dòng)子中的NHE III1區(qū)域的G4序列，從而激活C-myc[7-8]。通過(guò)后者進(jìn)一步完成相應(yīng)的生物學(xué)作用。該實(shí)驗(yàn)中，將不同濃度的nm23-H2抗體與C6細(xì)胞共培養(yǎng)，研究在Rho-GTPases/nm23通路中，nm23-H2所能發(fā)揮的作用。該研究證實(shí)，nm23-H2抗體通過(guò)對(duì)nm23-H2的抑制，可以在一定程度上，降低MMP-2蛋白的表達(dá)及磷酸化程度，表明nm23-H2與MMP-2蛋白之間必然存在某種聯(lián)系，說(shuō)明二者很有可能在上游蛋白水平存在調(diào)控機(jī)制，基因水平的調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后的修飾過(guò)程中可能存在影響，有待我們后期進(jìn)一步研究。

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R73

A

1674-0742（2014）12（a）－0042-02

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010CDZ068）。

林超（1981-），男，湖北宜昌人，碩士研究生在讀，主治醫(yī)師，研究方向：神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

艾文兵，男，教授，碩士生導(dǎo)師，郵箱：1043642574@qq.com。

2014-08-26）