免疫不孕奶牛與健康奶牛宮頸黏液蛋白表達(dá)及初步分析

馬夢(mèng)婷，陳曉莉，王姍姍，高慶華，3，馬 瑛

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；3.新疆塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300）

疾病防控

免疫不孕奶牛與健康奶牛宮頸黏液蛋白表達(dá)及初步分析

馬夢(mèng)婷1，2，陳曉莉1，王姍姍1，高慶華1，3，馬 瑛1

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾 843300；2.新疆塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300；3.新疆塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300）

為研究不孕與可孕奶牛間宮頸黏液蛋白質(zhì)的差異，揭示奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)與不孕的關(guān)系，采用二維凝膠電泳技術(shù)獲得了不孕與可孕奶牛宮頸黏液中總蛋白的表達(dá)圖譜，經(jīng)過(guò)Ymension Revolutionary 2DGE Software自動(dòng)匹配分析，得出不孕奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)上樣量分別為0.8 mg和1.6 mg時(shí)，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為134個(gè)和151個(gè)，檢測(cè)出具有明顯表達(dá)差異蛋白斑點(diǎn)數(shù)為17個(gè)。不孕與可孕奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)上樣量為1.6 mg時(shí)，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為151個(gè)和67個(gè)，有62個(gè)匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。證明不孕奶牛與可孕奶牛宮頸黏液蛋白中存在差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)。該試驗(yàn)將有助于解釋免疫性不孕奶牛宮頸黏液中的差異蛋白對(duì)生殖的影響，為改善診斷的特異性、治療免疫性不育提供理論基礎(chǔ)。

奶牛；宮頸黏液；雙向電泳；差異蛋白

哺乳動(dòng)物宮頸黏液（cervixmucus，CM）是宮頸內(nèi)膜腺體的一種復(fù)雜分泌物，來(lái)自子宮內(nèi)膜和輸卵管分泌液和卵泡液，以及子宮、子宮頸上皮和白細(xì)胞碎片［1］。宮頸黏液的質(zhì)與量受體內(nèi)雌性激素水平的調(diào)節(jié)，在發(fā)情周期中呈現(xiàn)明顯的規(guī)律性變化［2］。宮頸黏液是精子進(jìn)入受精部位的重要通道，在正常受精過(guò)程中起柵欄作用，還起到保護(hù)、輸送精子與保護(hù)宮腔的作用。但宮頸黏液也會(huì)由一些原因引起抗精子抗體（antisperm antibodies，ASA）滴度升高，而ASA是導(dǎo)致免疫不育的主要原因之一［3-4］，奶牛不孕癥中15%～20%是ASA免疫不育，監(jiān)測(cè)防控奶牛ASA免疫不育有重要的現(xiàn)實(shí)意義。在不孕癥個(gè)體的血清、精液、宮頸黏液、陰道分泌液甚至卵泡液中都不同程度地存在ASA，但宮頸是ASA作用集中的部位，直接與精子作用，因此研究宮頸黏液ASA具有重要意義［5］。利用高分辨率、高重復(fù)性的雙向電泳（two-dimension electrophoresis，2-DE）技術(shù)分析不孕與健康奶牛宮頸黏液中的差異蛋白［6］，建立宮頸黏液蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，可為進(jìn)一步了解宮頸黏液蛋白對(duì)生殖過(guò)程的影響提供理論基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)二維凝膠電泳建立免疫不孕奶牛與健康奶牛宮頸黏液蛋白圖譜，對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)差異進(jìn)行初步分析，篩選免疫不孕奶牛相關(guān)的新生物標(biāo)記分子，為蛋白質(zhì)水平研究奶牛免疫性不孕的發(fā)生機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

IPG膠條（ImmobilineTMDryStrip）購(gòu)自GE Healthcare公司；尿素、硫脲、IPGBuffer、CHAPS、碘乙酰胺、Tris、SDS等購(gòu)自Promega公司；硝酸銀、硫代硫酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、礦物油、二硫蘇糖醇（DTT）和低熔點(diǎn)瓊脂糖為Amresco公司產(chǎn)品；四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸胺和甘油為Sigma公司產(chǎn)品；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

IEF100等電聚焦儀，SE900垂直電泳儀及附件，Milli-Q超純水儀，高速低溫離心機(jī)（Sigma3K30型，德國(guó)），紫外分光光度計(jì)（T6型，北京），UMAX掃描儀，搖床（DSHZ-300A型），渦旋儀。

1.2 奶牛宮頸黏液標(biāo)本采集

參試牛來(lái)自阿克蘇五團(tuán)牛場(chǎng)和呼圖壁種牛場(chǎng)的7～8歲荷斯坦奶牛。以直腸檢查和外部觀察正常為基礎(chǔ)，根據(jù)牛場(chǎng)配種生產(chǎn)記錄和淺盤凝集檢測(cè)［7］為參考資料，確定24頭ASA陽(yáng)性不孕奶牛和14頭ASA陰性可孕奶牛。在奶牛發(fā)情盛期時(shí)直檢刺激宮頸，待其流出宮頸黏液后，用注射器收集到事先滅菌的青霉素小瓶中，密封，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 宮頸黏液制備

參照文獻(xiàn)［8］TCA-丙酮沉淀法制備宮頸黏液蛋白，并略作改進(jìn)。取100 μL宮頸黏液樣品，用-20℃預(yù)冷10% TCA-丙酮沉淀過(guò)夜，在4℃以12 000 g離心20 min，沉淀物用丙酮洗滌3次，自然晾干5 min。晾干后的宮頸黏液蛋白沉淀溶于約100 μL裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS）。采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)定量結(jié)果調(diào)整上樣量。

1.4 SDS-PAGE電泳分析

將定量后的蛋白質(zhì)10 μL與樣品緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl，10%SDS，5%巰基乙醇，20%甘油，0.2%溴酚藍(lán)）按1:1混合，沸水煮沸5 min。SDS-PAGE采用Laemmli電泳緩沖體系，12.5%分離膠，4%濃縮膠，15 μL上樣量，濃縮膠電壓50 V，分離膠電壓100 V，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部邊緣時(shí)即停止電泳。電泳結(jié)束后采用銀染，顯色后經(jīng)掃描儀掃描成像。

1.5 雙向電泳分析

1.5.1 等電聚焦 將定量后的宮頸黏液蛋白樣品與350 μL上樣緩沖液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，65 mmol/L DTT，0.2%IPG Buffer，0.001%溴酚藍(lán)）均勻混合加入聚焦盤中，將膠條覆蓋在樣品之上，進(jìn)行第一向等點(diǎn)聚焦。

1.5.2 SDS-PAGE電泳 等點(diǎn)聚焦結(jié)束后，將IPG膠條取出，分別用2%DTT、2.5%碘乙酰胺的平衡緩沖液依次平衡以還原和烷基化蛋白質(zhì)，然后用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行第二向分離，待溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到底部邊緣時(shí)停止電泳。取出凝膠，切角做記號(hào)。

1.5.3 蛋白質(zhì)染色 凝膠染色采用銀染的方法：固定20 min，銀染1 h，顯影5～15 min，中止顯色10 min。

1.5.4 圖像分析 用Dymension Revolutionary2D GE Software軟件對(duì)銀染后的凝膠圖像進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛宮頸黏液總蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果

用TCA-丙酮沉淀處理的奶牛宮頸黏液蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后可見，ASA陰性可孕奶牛和ASA陽(yáng)性不孕奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)存在很明顯的差異（圖1），而且各條帶之間界限比較清晰，說(shuō)明TCA-丙酮沉淀處理的奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳后能夠得到較好的分離。與雙向電泳相比，SDS-PAGE電泳可以反映出樣品處理的效果，并能快速直觀地表現(xiàn)總蛋白質(zhì)的分布情況，為奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜的構(gòu)建提供有效幫助。

圖1 奶牛宮頸黏液經(jīng)TCA-丙酮沉淀處理后SDS-PAGE電泳圖譜

2.2 不同上樣量雙向電泳結(jié)果比較

不孕奶牛宮頸黏液蛋白上樣量分別為0.8 mg和1.6 mg時(shí)，雙向電泳結(jié)果表明，0.8 mg蛋白上樣量較少，各個(gè)蛋白點(diǎn)較小，且不清晰（圖2A）；而1.6 mg蛋白上樣量各個(gè)蛋白點(diǎn)大而濃（圖2B）。說(shuō)明隨著上樣量的擴(kuò)大，低豐度表達(dá)蛋白斑點(diǎn)數(shù)明顯增加。以“斑點(diǎn)染色強(qiáng)度和面積3倍量的變化”為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蛋白表達(dá)圖譜進(jìn)行差異分析，檢測(cè)出具有明顯表達(dá)差異蛋白斑點(diǎn)數(shù)為17～21個(gè)，如圖2B中圓圈內(nèi)所示。

圖2 不孕奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)上樣量為0.8 mg（A）和1.6 mg（B）雙向電泳圖譜

2.3 可孕和不孕奶牛宮頸黏液雙向電泳結(jié)果比較

當(dāng)可孕奶牛與不孕奶牛宮頸黏液蛋白上樣量均為1.6 mg時(shí)，可孕奶牛宮頸黏液蛋白雙向電泳圖譜中獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)為67個(gè)（圖3A）；而在相同上樣量的條件下，不孕奶牛宮頸黏液蛋白雙向電泳圖譜中獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)為151個(gè)，經(jīng)過(guò)軟件匹配分析，匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)為62個(gè)，箭頭所示為不孕奶牛宮頸黏液特異蛋白點(diǎn)（圖3B）。

圖3 可孕奶牛（A）和不孕奶牛（B）宮頸黏液蛋白上樣量為1.6 mg的雙向電泳圖譜

3 討論

通過(guò)雙向電泳技術(shù)，對(duì)可孕奶牛與不孕奶牛的宮頸黏液建立2-DE圖譜并進(jìn)行初步差異蛋白分析，結(jié)果表明，不孕奶牛宮頸黏液蛋白隨著上樣量的擴(kuò)大，低豐度表達(dá)蛋白斑點(diǎn)數(shù)明顯增加，并且檢測(cè)出具有明顯表達(dá)差異蛋白斑點(diǎn)數(shù)17～21個(gè)。當(dāng)可孕和不孕奶牛宮頸黏液蛋白上樣量均為1.6 mg時(shí)，可孕奶牛宮頸黏液蛋白雙向電泳圖譜中獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)67個(gè)；而在相同上樣量條件下，不孕奶牛宮頸黏液蛋白雙向電泳圖譜中獲得蛋白斑點(diǎn)數(shù)151個(gè)，經(jīng)過(guò)軟件匹配分析，匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)62個(gè)。實(shí)驗(yàn)獲得較為滿意的雙向電泳圖譜的關(guān)鍵是樣品的處理和上樣量的控制，哺乳動(dòng)物組織液蛋白質(zhì)制備方法比較多，利用TAC-丙酮沉淀法有利于得到更多、全面的蛋白質(zhì)點(diǎn)，有利于得到更清晰、更全面的蛋白質(zhì)圖譜。該方法經(jīng)歷了沉淀—復(fù)溶的過(guò)程，可以簡(jiǎn)捷有效地去除雜質(zhì)，同時(shí)能防止丟失堿性蛋白質(zhì)，還能有效抑制蛋白酶活性，適用于不同蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)本，不會(huì)特異地造成某些蛋白質(zhì)的丟失，且可以通過(guò)略微增加沉淀的樣品量來(lái)加以彌補(bǔ)［7-8］，加之沉淀過(guò)程在低溫中進(jìn)行，避免了蛋白質(zhì)降解的弊端。實(shí)驗(yàn)所用銀染法的靈敏度為考馬斯亮藍(lán)染色的10～100倍，能夠更好地檢測(cè)到一些低豐度表達(dá)蛋白。

ASA能夠?qū)е虏溉閯?dòng)物免疫性不育，在奶牛受精過(guò)程中，精子重復(fù)被注入到生殖道中［11］。各種原因的生殖道黏膜損傷、炎癥和感染，都能使局部黏膜屏障作用減弱，生殖道局部黏膜的通透性增加，尤其是陰道黏膜局部pH值的改變［9］，使精子易被巨噬細(xì)胞攝取，精子抗原和精漿抗原經(jīng)過(guò)生殖道局部時(shí)被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，誘發(fā)局部或全身免疫應(yīng)答，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生局部和全身的ASA。此外，生殖道中微生物所攜帶的抗原可能與精子抗原相同，從而發(fā)生交叉反應(yīng)，因此抗微生物抗體的存在使ASA的發(fā)生率增高。在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)對(duì)ASA陽(yáng)性不孕奶牛和ASA陰性可孕奶牛宮頸黏液蛋白質(zhì)2-DE圖譜分析，發(fā)現(xiàn)二者存在明顯的差異表達(dá)蛋白斑點(diǎn)，這些差異蛋白中存在ASA，在此基礎(chǔ)上通過(guò)Western blot和質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些差異蛋白斑點(diǎn)做進(jìn)一步鑒定，將有助于從分子水平闡釋免疫性不孕奶牛宮頸黏液中的差異蛋白對(duì)生殖的影響，為改善診斷的特異性、治療免疫性不育提供理論基礎(chǔ)，也可為發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶標(biāo)和治療方式提供依據(jù)。

［1］WHO.WHOlaboratorymanual for the examination ofhuman semen and semen-cervical mucus interaction［M］.2nd Edition.Cambridge：Cambridge UniversityPress，1987：26.

［2］Lin Ming，Lei Liang-yu，ZhangTing-hua，et al.Changes ofaminoacid content in cervix mucus of cowat the time pre-and post-ovulation［J］. Developmental&Reproductive Biology，2001，10：45-52.

［3］Naz R K.Modalitles for treatment of antisperm antibody mediated infertility：novel perspectives［J］.AIRI,2004，51（5）：390-397．［4］Bohring C，Krause W.The role of antisperm antibodies during fertilizationandforimmunologicalinfertility［J］.ChemImmunolAllergy，2005，88（1）：15-26．

［5］Waltraud Eggert-Kruse，Stefanie Bockem-Hellwig，Anette Doll，et al. Antisperm antibodies in cervical mucus in an unselected subfertile population［J］.Human Reproduction,1993，8（7）：1025-1031.

［6］States D J，Omenn G S，Blackwell T W，et al.Challenges in driving high-confidence protein identifications from data gathered by a HUPO plasma proteome collaborative study［J］.Nature Biotechnol，2006，24： 333-338.

［7］Jiang G L,He L，F(xiàn)ountoulakis M.Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis［J］.J Chromatogr A，2004，1023（2）：317-320.

［8］Gorg A，Weiss W，Dunn M J.Current two dimensional electrophoresis technologyfor proteomics［J］.Proteomics,2004，4（12）：3665-3685.

［9］Waltraud Eggert-Kruse，Isabel Botz，Sabine Pohl，et al.Antimicrobial activityofhuman cervical mucus［J］.Human Reproduction，2000，15（4）：778-784.

Preliminary Analysis on Proteome Maps of Cervix Mucus in Infertility and Healthy Dairy Cows

Ma Mengting1，2，Chen Xiaoli1，GaoQinghua1，3，et al
（1.KeyLaboratoryofTarimAnimal HusbandryScience and TechnologyofXinjiangProduction and Construction Groups，TarimUniversity，Alar 843300，China；2.College ofLife Science，TarimUniversity，Alar 843300，China；3.College ofAnimal Science，TarimUniversity，Alar 843300，China）

Tofurther explore the relationship between dairycows cervixmucus and the infecundityat protein level and analyze the expression changes ofproteins in cervixmucus offertile and infertile dairycows，the proteome expression profile of the fertile and infertile dairy cows’cervix mucus were obtained by 2D-PAGE.When the cervix mucus sample quantity were 0.8 mg and 1.6 mg，the number ofthe protein spot were 134 and 151 respectively，the differential protein expression was 17.When the fertile and infertile dairycows’cervixmucus sample quantitywere 1.6 mg，the number ofthe protein spot were 151 and 67 respectively，the number ofthe match protein spot was 62.The results indicated that there were significant differences in expression protein between fertile and infertile dairycows，and valuable information might be provided tofind newregulation markers ofmastitis and potential protein targets for treatment.

dairycow；cervixmucus；two-dimensional electrophoresis；differentiallyexpressed protein

S858.23

A

2095-3887（2014）06-0043-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.012

2014-09-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（31060306）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)畜牧重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（HS20803）

馬夢(mèng)婷（1991-），碩士。

高慶華，教授，博士。