苜蓿組織培養(yǎng)中一種安全快捷的種子滅菌法

王春梅，張 茜，張懷山，朱新強(qiáng)，王曉力

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

草地與牧草

苜蓿組織培養(yǎng)中一種安全快捷的種子滅菌法

王春梅，張 茜，張懷山，朱新強(qiáng)，王曉力

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050）

文章比較了0.1%升汞+10%NaClO+70%乙醇；10%NaClO+70%乙醇；10%NaClO+70%乙醇+1:15潔爾滅等不同消毒方法對(duì)苜蓿種子的滅菌效果，并分析了1/2 MS培養(yǎng)基和濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液兩種萌發(fā)介質(zhì)對(duì)萌發(fā)率、污染率、生長(zhǎng)時(shí)間的影響。結(jié)果表明：0.1%升汞+10%NaClO+70%乙醇和10%NaClO+70%乙醇+1:15潔爾滅的消毒方法污染率最低，且后一種方法對(duì)操作人員相對(duì)安全；濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液的發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)速度較快，污染率也較低。綜合效果表明：10%NaClO+ 70%乙醇+1:15潔爾滅與1/2 MS培養(yǎng)液+濾紙的組合安全快捷，效果最佳。

苜蓿；組織培養(yǎng)；安全；快捷

紫花苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草。紫花苜蓿適應(yīng)性高、產(chǎn)量好、營(yíng)養(yǎng)豐富，粗蛋白含量可達(dá)18%～26%，其他如礦物質(zhì)、維生素的含量也很高，素有“牧草之王”的美稱［1］。作為飼料牧草，在全世界種植面積高達(dá)3 300萬hm2，在畜牧業(yè)中占有舉足輕重的地位［2］。但是苜蓿經(jīng)過多年人工栽培馴化，大多數(shù)抗逆性較差。尤其是近年來受全球氣候變化和人口不斷增長(zhǎng)的影響，草場(chǎng)鹽堿化程度日益加重，牧草產(chǎn)量迅速降低，需要培育耐鹽抗旱苜蓿品種［3］。為了獲得耐鹽堿抗干旱更好的品種，我國(guó)許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)其再生體系做了大量研究［5-6］。分子標(biāo)記輔助選育和轉(zhuǎn)基因等手段為有效提高苜?？鼓嫘蕴峁┝诵碌倪x擇。苜蓿轉(zhuǎn)基因育種的關(guān)鍵之一是組織培養(yǎng)與植株再生。為了利用苜蓿種子獲得組織培養(yǎng)外植體，本研究比較分析了3種消毒方法對(duì)苜蓿種子的滅菌效果，篩選出了一種適合苜蓿種子的安全快速的消毒方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

“中蘭1號(hào)（Medicago Sativa cv.Zhonglan No.1）”紫花苜蓿由中國(guó)農(nóng)科院蘭州畜牧研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基與滅菌方法

1/2MS培養(yǎng)基，濾紙+1/2MS培養(yǎng)液；pH值5.8，121℃高壓滅菌鍋滅菌20 min。

1.3 消毒處理

挑選籽粒飽滿的成熟腎形苜蓿種子，先用流水進(jìn)行沖洗，去掉泥沙，之后用去離子水清洗3遍，放入去離子水中浸泡過夜后進(jìn)行種子消毒處理。處理1：以傳統(tǒng)的升汞為主的滅菌方法為基礎(chǔ)，0.1%升汞10 min+10% NaClO 2 min+70%乙醇 60 s；處理 2：去掉升汞，10% NaClO 5 min+70%乙醇60 s；處理3：添加新潔爾滅，10% NaClO 2 min+70%乙醇 60 s+1:15新潔爾滅（苯扎溴銨）5 min。

1.4 種子萌發(fā)

消毒后的種子分別置于1/2 MS培養(yǎng)基和1/2 MS培養(yǎng)液+濾紙兩種培養(yǎng)介質(zhì)上進(jìn)行萌發(fā)。

1.5 愈傷組織培養(yǎng)

將各處理苜蓿外植體（下胚軸）接種于添加2.5 mg/L 2，4-D和0.5 mg/LKT的MS培養(yǎng)基，在25℃條件下暗培養(yǎng)3周后觀察愈傷組織的生長(zhǎng)情況，并做好統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)介質(zhì)和消毒方法對(duì)萌發(fā)率的影響

如圖1所示，苜蓿種子在1/2 MS培養(yǎng)基中3種消毒方式的萌發(fā)率分別為90.3%，90.7%，91.7%；在濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液中3種消毒方式的萌發(fā)率分別為92.0%，93.0%，92.3%?？梢姡痉绞綄?duì)種子萌發(fā)率沒有明顯影響，而濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液的處理比1/2 MS提高了萌發(fā)率。

圖1 不同培養(yǎng)介質(zhì)和消毒方法對(duì)萌發(fā)率的影響

2.2 不同培養(yǎng)介質(zhì)和消毒方法對(duì)幼苗生長(zhǎng)時(shí)間的影響

如圖2所示，苜蓿種子在1/2 MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)至可做外植體的無菌苗，即根長(zhǎng)2～3 cm、子葉張開、出現(xiàn)第一片真葉的時(shí)間，在3種消毒處理下均為4 d。而濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液中3種消毒方式的時(shí)間均為3 d，時(shí)間較短。

圖2 不同消毒方式下培養(yǎng)無菌苗所需時(shí)間

2.3 不同消毒方式對(duì)污染率和出愈率的影響

由表1可見，處理1中細(xì)菌和真菌污染率分別為1.3%、0.7%，出愈率90.8%；處理2中細(xì)菌和真菌污染率分別為3.0%、4.3%，出愈率85.8%；處理3中細(xì)菌和真菌污染率分別為1.7%、1.0%，出愈率89.6%。

表1 不同消毒方式對(duì)污染率和出愈率的影響

3 討論

低濃度的Hg2+（升汞）可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活，但也是一種劇毒的重金屬鹽殺菌劑，對(duì)操作人員有害，且廢棄液對(duì)環(huán)境中的水安全存在很大的安全隱患［7］。新潔爾滅［8］（苯扎溴銨）是陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑，能改變細(xì)菌胞漿膜通透性，使菌體胞漿物質(zhì)外滲，阻礙其代謝而起殺滅作用，0.1%以下濃度對(duì)皮膚無刺激性。通常用于手術(shù)前皮膚消毒，粘膜和傷口消毒，手術(shù)器械消毒。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用醫(yī)用消毒劑新潔爾滅代替升汞與乙醇、次氯酸鈉結(jié)合的方式與升汞一樣能起到很好的滅菌效果，比只用乙醇、次氯酸鈉消毒效果好，消毒時(shí)間短，且對(duì)人體相對(duì)安全。

在3種不同處理方式下，接種在濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液上的苜蓿種子萌發(fā)率均比接種在1/2MS培養(yǎng)基上的要高，且能縮短成苗時(shí)間。其原因可能是：苜蓿種子的萌發(fā)需要水分與氧氣，將種子接種于加有培養(yǎng)液的濾紙上，可以充分保證種子萌發(fā)提供的氧氣與水分，促進(jìn)萌發(fā)。直接接種于培養(yǎng)基中，由于培養(yǎng) 基是果凍狀膠體，種子吸水相對(duì)困難，且可能使接觸面接觸不到空氣影響萌發(fā)率。

因此，綜合上述分析，苜蓿組織培養(yǎng)中種子的萌發(fā)和消毒工作，可以采用濾紙+1/2 MS培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基和10%NaClO 2 min+70%乙醇60 s+1:15新潔爾滅5 min消毒結(jié)合的方式最佳，也可適當(dāng)調(diào)整應(yīng)用于其他植物的種子消毒。

［1］楊培志，陳小燕，趙鎖柱，等.中國(guó)苜蓿繁育概述［J］.牧草科學(xué)，2004（2）：81-84.

［2］李望豐，呂德?lián)P，劉艷芝，等.誘導(dǎo)苜蓿胚性愈傷組織分化和再生［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，27（2）：15-16.

［3］李取生，宋玉祥，趙春生.吉林西部草地鹽堿化治理對(duì)蕞研究［J］.農(nóng)業(yè)系統(tǒng)科學(xué)與綜合研究,2001，l7（4）：304-309.

［5］王錦.紫花苜蓿植物學(xué)特征及基因工程研究現(xiàn)狀［J］.農(nóng)家科技，2012（8）：139.

［6］桂枝，高建明.我國(guó)苜蓿育種的研究進(jìn)展［J］.天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，10（1）：37-41.

［7］何瑞，湯行春.生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室升汞污染的解決方案［J］.生物學(xué)通報(bào)，2010，45（2）：49-50.

［8］曉芳，董開忠，王冬梅，等.新潔爾滅對(duì)三種細(xì)菌的抑菌效果研究［J］.西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，30（1）：64-66.

A Safe and Fast Sterilization for Alfalfa Seed in Tissue Culture

WangChun-Mei，ZhangQian，WangXiao-Li
（Lanzhou Institute ofHusbandryand Pharmaceutical Sciences ofCAAS，Lanzhou 730050，China）

Comparison effect of different seed sterilization methods on alfalfa as follows：0.1%HgCl2+10%NaClO+70%ethanol；10%NaClO+70%ethanol；and 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine.Meanwhile，analyzingthe effect of1/2 MSculture medium and filter paper+1/2 MS solution on germination rate，pollution rate and growth time of alfalfa.The results showed that pollution rate was the lowest under both 0.1%HgCl2+10%NaClO+70%ethanol and 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine disinfection method；moreover，the later method was a relativelysafe method for operatingpersonnel.The germination rate and seedling growth speed were higher under filter paper+1/2 MS medium than 1/2 MS culture medium，while the pollution rate was lower.So，the safe and fast combination method is 10%NaClO+70%ethanol+1:15 bromogeramine+filter paper+1/2 MS solution.

alfalfa；tissue culture；safe；rapid

S54

A

2095-3887（2014）05-0038-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.011

2014-07-31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31201841）；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（1610322013011）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203042）

王春梅（1981-），女，助理研究員。

王曉力，女，副研究員。