谷氨酰胺和IGF-I對晉嵐絨山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

張春香，秦 雪，鄭亞琳，張彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

谷氨酰胺和IGF-I對晉嵐絨山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

張春香，秦 雪，鄭亞琳，張彩霞，岳文斌，任有蛇，靳 黎

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

為了探討在成熟培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和IGF-I對晉嵐絨山羊母羔卵母細(xì)胞體外成熟的影響。隨機選擇12只6～8周齡晉嵐絨山羊母羔為試驗動物，用FSH進(jìn)行超數(shù)排卵，活體采集卵母細(xì)胞，并對未成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。在培養(yǎng)液中添加0、50、100和150 μg/mL的谷氨酰胺及0、25、50和100 ng/mL的IGF-I。結(jié)果表明：培養(yǎng)液中谷氨酰胺添加量為100 μg/mL時，能顯著提高卵母細(xì)胞成熟率（P<0.05）；在培養(yǎng)液中添加100 μg/mL谷氨酰胺的基礎(chǔ)上，再添加50 ng/mL的IGF-I可以進(jìn)一步顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率（P<0.01）。

晉嵐絨山羊母羔；卵母細(xì)胞；體外成熟；谷氨酰胺；IGF-I

類胰島素樣生長因子（IGF-I）是一種常用的生長因子，通過自分泌或旁分泌的途徑，刺激各類細(xì)胞的增殖和生長［1］。IGF-I對卵母細(xì)胞的成熟是有雙向作用的，在一定濃度范圍內(nèi)對卵母細(xì)胞的成熟有促進(jìn)作用，但濃度過高對卵母細(xì)胞成熟就有一定的抑制作用。在牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加100 ng/mL的IGF-I顯著提高了卵母細(xì)胞的成熟率［2］。然而在水牛的成熟培養(yǎng)液中添加30 ng/mL的IGF-I可顯著提高卵母細(xì)胞的成熟率，當(dāng)添加濃度增加到100 ng/mL時，卵母細(xì)胞成熟率與對照組無顯著差異［3］。IGF-I可使山羊無腔卵泡細(xì)胞的直徑增加，存活力提高［4］。體外成熟培養(yǎng)液添加谷氨酰胺可增強卵母細(xì)胞抗氧化作用，提高卵母細(xì)胞成熟率和受精后的胚胎發(fā)育率［5-6］。然而關(guān)于谷氨酰胺和IGF-I對山羊卵母細(xì)胞成熟影響的研究還較少。本研究利用6～8周齡晉嵐絨山羊羔羊超數(shù)排卵獲得的未成熟卵母細(xì)胞為研究對象，在成熟培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺和IGF-I，以探尋山羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中最佳的谷氨酰胺和IGF-I添加濃度，為改善羔羊超數(shù)排卵體外生產(chǎn)胚胎的效率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗羔羊及超排方案 本試驗選用6～8周齡、體重相近、營養(yǎng)狀況及健康狀況良好的12只晉嵐絨山羊母羔作為超數(shù)排卵對象，于早晨9：00和下午5：00分2次注射FSH 4 mg（BIONICHE Animal Health Canada INC），連續(xù)注射2 d，最后1次注射FSH時同時注射PMSG400 IU

（寧波三生藥業(yè)有限公司）。每次處理2只。試驗動物由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院生態(tài)畜牧站提供。

1.1.2 卵母細(xì)胞的采集 采用手術(shù)活體取卵法。試驗羔羊空腹12 h后進(jìn)行卵母細(xì)胞采集。試驗前用0.02 mg/kg的靜松靈進(jìn)行麻醉，頭部朝下倒置仰臥保定于專用手術(shù)架上，局部消毒后，腹部切口打開腹腔，用食指和中指拉出子宮和卵巢，用帶有采卵液2 mL一次性注射器從直徑大于2 mm卵泡中抽吸，在體視鏡下?lián)斐鲂螒B(tài)正常、胞質(zhì)均勻的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體，記錄每只羔羊所獲得的可用卵母細(xì)胞數(shù)。

1.2 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)

在體視鏡下將A級卵丘細(xì)胞—卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）撿出，統(tǒng)計卵母細(xì)胞數(shù)量。用預(yù)熱的采卵液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，BSA 3 mg/mL，heparin 10 μg/mL，2%（v/v）P-S）洗3次，再隨機分配到卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液，用基礎(chǔ)成熟液（TCM199 9.5 mg/mL，NaHCO32.2 mg/mL，hepes 5.958 mg/mL，sodium pyruvate 0.3 mmol/L，10%FBS，2%（v/v）P-S）沖洗2次，備用。

試驗1：將每次收獲的卵母細(xì)胞平均分為4份，放入預(yù)平衡好的四孔板（成熟培養(yǎng)液600 μL，覆蓋石蠟油280 μL），在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入谷氨酰胺，使4個孔中成熟培養(yǎng)液中谷氨酰胺的終濃度分別達(dá)到 0、50、100和 150 μg/mL。每孔卵母細(xì)胞的數(shù)量 25～40個。于38.6℃、5%CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。該試驗重復(fù)3次。

試驗2：培養(yǎng)過程和重復(fù)次數(shù)同試驗1。在含試驗1篩選最佳添加濃度谷氨酰胺成熟培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，其中3孔分別添加25、50和100 ng/mL的IGF-I，1孔為對照組，不添加谷氨酰胺和IGF-I。

1.3 卵母細(xì)胞的成熟鑒定

通過觀察卵母細(xì)胞形態(tài)來判斷成熟情況，成熟卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞擴散，呈放射狀。放入0.1%的透明質(zhì)酸酶中，用玻璃細(xì)管反復(fù)吹打卵母細(xì)胞，至完全除去卵丘細(xì)胞為止。撥動卵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，以排出第一極體（PBI）作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志。

1.4 細(xì)胞計數(shù)及統(tǒng)計分析

試驗結(jié)束后在體視顯微鏡下觀察記錄排出第一極體的成熟卵母細(xì)胞的數(shù)量，計算成熟卵母細(xì)胞所占百分比。數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 卵母細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

未成熟卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)分別見圖1和圖2。圖1為未成熟卵母細(xì)胞，胞質(zhì)均勻，外層包裹著3層以上的卵丘顆粒細(xì)胞；圖2為成熟卵母細(xì)胞，在400倍下可以清晰地觀察到排出的第一極體。

2.2 培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺對卵母細(xì)胞成熟的影響

該試驗組6只晉嵐絨山羊母羔超排共收獲可用的COCs 404個，平均每只收獲可用67.3個±13.6個。圖3結(jié)果顯示，與對照組相比，成熟液中添加50、100和150 μg/mL谷氨酰胺卵母細(xì)胞成熟率分別增加了6.74%、27.74%和11.12%，添加100 μg/mL谷氨酰胺組的成熟率顯著高于 50 μg/mL組和 150 μg/mL組（P<0.05），極顯著高于對照組（P<0.01）。添加150 μg/mL組顯著高于對照組（P<0.05）。由此可知，體外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加濃度為100 μg/mL。

圖3 培養(yǎng)液中添加谷氨酰胺對卵母細(xì)胞成熟的影響

2.3 培養(yǎng)液中添加IGF-I對卵母細(xì)胞成熟的影響

該試驗組6只晉嵐絨山羊母羔超排共收獲可用COCs 416個，平均每只收獲可用69.3個±7.8個。在含有100 μg/mL谷氨酰胺的體外成熟液中添加不同濃度

的IGF-I對卵母細(xì)胞成熟率影響的結(jié)果見圖4。與對照組相比，成熟液中添加25、50和100 ng/mL的IGF-I卵母細(xì)胞成熟率分別增加了8.68%、32.55%和19.71%，添加50 ng/mL和100 ng/mL的IGF-1組的成熟率顯著高于25 ng/mL（P<0.05），極顯著高于對照組（P<0.01）。添加25 ng/mL組又顯著高于對照組（P<0.05）。

圖4 培養(yǎng)液中添加IGF-I對卵母細(xì)胞成熟的影響

3 討論

3.1 谷氨酰胺對卵母細(xì)胞成熟的影響

氨基酸在卵母細(xì)胞體外成熟過程中作用顯著，尤其谷氨酰胺是體液中最豐富的氨基酸之一，一直是研究者們研究的熱點。谷氨酰胺是L-谷氨酸的羧基酰胺化物，對維持細(xì)胞體積，增加細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有一定作用。另外，成熟卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的GSH（谷胱甘肽）濃度可反映卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟程度［7］。而卵母細(xì)胞GSH合成是以半胱氨酸以及谷氨酰胺作為底物。加入這兩種氨基酸不論是對哺乳動物的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟，還是細(xì)胞核的成熟都有著很大的益處［8］。本試驗結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著谷氨酰胺濃度的增加，卵母細(xì)胞體外成熟率呈現(xiàn)上升趨勢，這一研究結(jié)果與目前關(guān)于谷氨酰胺的報道相一致［6，9］，并確定了山羊卵母細(xì)胞體外成熟液中谷氨酰胺的最佳添加劑量為100 μg/mL。

3.2 IGF-I對卵母細(xì)胞成熟的影響

IGF-I在調(diào)節(jié)卵泡的生長發(fā)育方面起著重要作用，在未成熟的卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞中均有IGF-I和IGF-IR表達(dá)［10］。IGF-I的主要功能在于促進(jìn)由FSH介導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的分化和增殖，使得卵母細(xì)胞的體外活力和生長能力得以提高。但I(xiàn)GF-I對卵母細(xì)胞的成熟是有雙向作用的，在一定濃度范圍內(nèi)對卵母細(xì)胞的成熟有促進(jìn)作用。本試驗結(jié)果表明，添加IGF-I濃度在50ng/mL范圍內(nèi)卵母細(xì)胞的成熟率呈現(xiàn)上升趨勢，與魯進(jìn)等在山羊體外成熟培養(yǎng)液中添加20 ng/mL和30 ng/mL的IGF顯著提高了成熟率的研究結(jié)果一致［11］。然而當(dāng)IGF-I添加量增加到100 ng/mL時，卵母細(xì)胞成熟率低于50 ng/mL組，表明高濃度的IGF-I對卵母細(xì)胞成熟有明顯的抑制作用。

4 結(jié)論

培養(yǎng)液中同時添加100 μg/mL谷氨酰胺和50 ng/mL的IGF-I可以顯著提高晉嵐絨山羊卵母細(xì)胞的體外成熟率。

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doi:10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.008

Effect of Glutamine and IGF-I on the Oocyte maturation of Jinlan Cashmere Goats

ZhangChun-xiang，Qin Xue，Ren You-she，et al
（Animal Science College，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The objective ofthe study was to investigate the effect of glutamine and IGF-I on oocyte maturation in Jinlan Cashmere goats.Twelve 6-8 week-old Jinlan cashmere female kids were selected to superovulate by FSH injection.The immature oocytes were collected by ovum pick-up,and culture in vitro maturation with supplementation of different concentration of glutamine（0，50，100 and 150 μg/mL）and IGF-I（0，25，50 and 100 ng/mL）in maturation media.The results showed that the maturation rate of oocytes could be significantly improved by adding 100 μg/mL glutamine to the maturation media（P<0.05).After addition 100 μg/mLglutamine，adding50 ng/mLIGF-I could markedlyincrease the rate ofoccytes maturation（P<0.01）.

Jinlan cashmere female kids；oocyte；in vitro maturation；glutamine；IGF-I

S827.3

A

2095-3887（2014）05-0026-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.007

2014-08-14

山西省科技攻關(guān)計劃項目（20110311029）

張春香（1972-），女，副教授，博士，主要從事動物營養(yǎng)與繁殖生理學(xué)方面的研究。

任有蛇（1970-），男，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物繁殖方面的研究。