云南半細毛羊毛囊干細胞無血清培養(yǎng)體系的建立

呂春榮，權(quán)國波，歐陽依娜，沈 偉，洪瓊花

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)）

繁殖與生理

云南半細毛羊毛囊干細胞無血清培養(yǎng)體系的建立

呂春榮1，權(quán)國波1，歐陽依娜1，沈 偉2，洪瓊花1

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)）

試驗旨在研究云南半細毛羊毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定方法，為下一步的誘導(dǎo)分化研究奠定基礎(chǔ)。方法：采用組織塊法原代培養(yǎng)云南半細毛羊HFSCs。并對分離得到的細胞進行免疫組化鑒定。培養(yǎng)結(jié)果：HFSCs為貼壁生長細胞，體積小，核質(zhì)比高，呈典型的鋪路石狀，在顯微鏡下折光性強、胞體透亮。免疫組化分析結(jié)果表明：細胞表達K14、不表達CD271。證明所培養(yǎng)的細胞為HFSCs。結(jié)論：試驗采用組織塊培養(yǎng)法初步建立了云南半細毛羊無血清培養(yǎng)HFSCs，這對于探討云南半細毛羊毛囊生長發(fā)育調(diào)控機制以及成體干細胞增殖分化特性具有非常重要的意義。

云南半細毛羊；毛囊干細胞；分離培養(yǎng)

近年來，隨著上皮生物學(xué)和組織工程皮膚研究的不斷深入，毛囊干細胞（HFSCs）研究已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。HFSCs來源豐富，取材方便，又避免了倫理和道德方面的限制。然而，目前HFSCs研究主要集中于人和小鼠，研究重點主要偏向于臨床應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，位于毛囊隆突部的HFSCs不僅對毛發(fā)周期的維持具有重要意義，而且與皮膚損傷修復(fù)、組織維持和更新、皮膚腫瘤的發(fā)生等都密切相關(guān)［1］。

開展云南半細毛羊HFSCs研究對于半細毛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有非常重要的意義。體外培養(yǎng)半細毛羊HFSCs，對于探討半細毛羊毛囊生長規(guī)律、生長調(diào)節(jié)機制等研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)，并最終實現(xiàn)改善羊毛品質(zhì)，提高羊毛產(chǎn)量和質(zhì)量。有關(guān)綿羊HFSCs的報道，僅有郭婷婷等［2］開展了細毛羊HFSCs分離培養(yǎng)方法比較研究。一些學(xué)者開展了山羊HFSCs的研究。史明艷等［3］研究結(jié)果表明：組織塊法和酶消化法均能分離得到山羊HFSCs并進行傳代，但隨著傳代次數(shù)的增加，組織塊法獲得的細胞免疫組化染色陽性率、克隆形成率以及傳代能力均顯著

高于酶消化法獲得的細胞。此外，也有學(xué)者開展了羊駝HFSCs的研究。弓慧敏等［4］分離得到羊駝單個毛囊，再利用0.2%的中性蛋白酶消化獲得HFSCs并進行細胞培養(yǎng)。

本試驗首次建立了無血清HFSCs培養(yǎng)體系，并進行了形態(tài)學(xué)和分子標記物鑒定，初步證明培養(yǎng)的細胞為HFSCs。該項研究對于探索半細毛羊毛囊生長發(fā)育規(guī)律具有非常重要的意義。同時為下一步HFSCs誘導(dǎo)分化研究奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

云南半細毛羊由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院實驗基地提供，試驗用組織塊取自成年羊背部皮膚。

1.2 主要試劑

胰蛋白酶和青鏈霉素溶液（PS）購自Bioind公司；DMEM/F12和 B27購自 Gibco公司；b-FGF購自 PEPROTECH公司；表皮生長因子（EGF）和K14購自Abcam公司；CD271購自Pierce公司。其余試劑如無特殊說明，均購自Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 HFSCs的分離培養(yǎng) 取云南半細毛羊背部皮膚樣本0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理鹽水+1%PS洗3次，手術(shù)刀片刮去皮膚表面污物。手術(shù)剪和鑷子剔除多余脂肪及結(jié)締組織后，剪成0.1 cm×0.1 cm×0.3 cm的皮膚塊。將皮膚塊在緩沖液（DMEM-F12+1%PS）中洗3次。體視鏡下用眼科鑷將毛囊從皮膚真皮層拔出。毛囊收集后在緩沖液中洗3次后，移入12孔板中，每孔4～6根，加入0.5 mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)液：DMEM-F12+bFGF 40 ng/mL+EGF 20 ng/mL+B27 20 μL/mL+1%PS。最后放入培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2、飽和濕度）中培養(yǎng)。體視顯微鏡觀察、照相、記錄細胞遷移和增殖情況。

1.3.2 HFSCs的傳代培養(yǎng) 當細胞長至80%時，將培養(yǎng)液棄去，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶（含0.01%EDTA）在37℃消化5～8 min后，倒置顯微鏡下觀察，細胞開始變圓時加細胞培養(yǎng)液終止消化，反復(fù)吹打細胞使其完全脫落，以1:2的比例進行傳代。倒置顯微鏡下觀察傳代細胞生長狀況，并拍照。

1.3.3 HFSCs的免疫組化鑒定 制備細胞爬片，參照各抗體說明進行K14、CD271免疫熒光檢測。步驟如下：細胞爬片用PBS緩沖液（pH值7.2～7.4）清洗3次，每次5 min；4%的多聚甲醛室溫固定30 min，PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；0.3%TritonX-100處理10 min，PBS緩沖液洗3次，每次5 min；用含10%山羊血清的PBS在37℃，封閉30 min；PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；滴加適當稀釋的一抗，對照組用PBS代替一抗，置于濕盒內(nèi)，4℃過夜。PBS緩沖液清洗3次，每次5 min；滴加稀釋后的熒光素標記二抗IgG，置于濕盒內(nèi)，37℃保溫1 h。PBS緩沖液PBS洗3次，每次5 min。放置激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 HFSCs原代培養(yǎng)

從毛囊遷移出來的上皮樣細胞貼壁生長（平均約5 d），細胞呈鑲嵌多角形，折光性強，表現(xiàn)為鋪路石樣；核大而明顯，多偏居于細胞一側(cè)（如圖1A所示）。2～3 d后，細胞開始匯合，最終形成密集的片狀克隆（如圖1B所示）。

圖1 組織塊法培養(yǎng)HFSCs形態(tài)

2.2 HFSCs傳代培養(yǎng)

傳代培養(yǎng)的云南半細毛羊HFSCs放大后清晰可見，細胞間界限明顯，呈鋪路石樣，核質(zhì)比大，多個核仁（如圖2A、2B所示）。形態(tài)上完全符合HFSCs的基本特征。

圖2 第3代HFSCs形態(tài)

2.3 HFSCs的免疫組化鑒定

由于HFSCs尚無高度特異性的表面標志，因此本試驗采取K14、CD271對其進行共同鑒定。免疫組化結(jié)果表明，HFSCs表達K14（如圖3B所示），而不表達CD271（如圖3A所示）。通過對原代和第5代細胞進行鑒定后，筆者認為所培養(yǎng)的細胞為HFSCs。

圖3 組織塊法培養(yǎng)HFSCs形態(tài)

3 討論

目前，HFSCs研究多集中于人和小鼠。實驗室研究多以鼠觸須為模型，從中分離隆突部干細胞。由于鼠觸須不僅毛囊體積大，而且隆突部位明顯，易于顯微操作。在顯微鏡下分離、切取毛囊后，用酶直接消化隆突部，獲得單個細胞。還有報道從人頭枕部毛發(fā)分離干細胞，主要采取拔毛法，從枕部皮膚中拔出完整毛囊，然后用胰酶消化獲得干細胞。根據(jù)目前報道，國內(nèi)外尚未見到綿羊HFSCs體外無血清培養(yǎng)體系。本試驗組用DMEM-F12+bFGF 40 ng/mL+EGF 20 ng/mL+B27 20 μL/mL+1%PS無血清培養(yǎng)液，首次建立了綿羊HFSCs體外無血清培養(yǎng)體系，并對獲得的HFSCs進行了形態(tài)學(xué)和分子標志物鑒定，初步證實培養(yǎng)的細胞為HFSCs。

3.1 HFSCs體外無血清培養(yǎng)

體外培養(yǎng)HFSCs所用培養(yǎng)液根據(jù)是否添加有血清，分為有血清培養(yǎng)體系和無血清培養(yǎng)體系。傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法必須在培養(yǎng)液中加入一定比例的血清以利其生長，但各血清間所含的生長因子和激素以及其他一些因素隨批次的變化非常大，這就影響了對細胞生長的調(diào)節(jié)機制。楊婷等［5］比較無血清及含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的人臍帶間充質(zhì)干細胞（UC-MSC）生物學(xué)特性，尋求無血清的UC-MSC培養(yǎng)方法。結(jié)果表明：無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的UC-MSC細胞較小、傳代增殖潛能較強、無異種蛋白，而且抑制T細胞增殖作用更明顯。體外培養(yǎng)和擴增大鼠

毛囊Bulge細胞，無血清的K-SFM培養(yǎng)基較有血清DMEM-Fl2培養(yǎng)基更有利于Bulge細胞的擴增和表型的維持［6］。

很多試驗研究證實，無血清培養(yǎng)基更有利于毛囊的生長。張兆遠［7］通過對濟寧青山羊皮膚毛囊體外培養(yǎng)研究得出：對于山羊游離毛囊的體外培養(yǎng)，無血清的Williams E培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基均是適宜的，但在Williams E培養(yǎng)基中的生長速度更快，說明Williams E培養(yǎng)基更適合山羊游離毛囊的培養(yǎng)。崔志峰等［8］建立了適宜山羊毛囊體外培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基，通過添加谷氨酰胺、氫化可的松、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉等成分，在31℃、95%空氣和5%CO2條件下，可將山羊毛囊培養(yǎng)到30d以上，并確定添加血管內(nèi)皮生長因子和表皮生長因子可促進毛囊的生長。

國內(nèi)學(xué)者對細毛羊和山羊HFSCs進行了研究，并初步建立了HFSCs的分離和培養(yǎng)技術(shù)體系，但他們采用的培養(yǎng)體系并不是無血清培養(yǎng)體系［2-3］。在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，如何長期保持干細胞的生物學(xué)特性至今仍是個難題。成分復(fù)雜的培養(yǎng)基中血清是個難以去除的干擾因素。本試驗首次使用無血清的DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)云南半細毛羊HFSCs，并使其在體外培養(yǎng)條件下能較好地保持其生物學(xué)特性。從而為體外穩(wěn)定培養(yǎng)HFSCs及進一步研究其分化提供了堅實的實驗基礎(chǔ)。

3.2 HFSCs的鑒定

不同種類的干細胞都具有各自的形態(tài)特征。這也是鑒定干細胞的傳統(tǒng)方法之一。從細胞的形態(tài)上來說，本試驗分離培養(yǎng)的細胞呈立方形，細胞體積小，細胞大小一致，核大而明顯且多偏居于細胞一側(cè)，核漿比大，表面多隆起，皺折少，可初步判定為HFSCs。

體內(nèi)HFSCs用標記滯留法鑒定，而體外分離培養(yǎng)的HFSCs則用特異性標記來鑒定。Ma等［9］報道潛在的HFSCs特異性標記主要包括：β1-integrin、K15、K19、轉(zhuǎn)鐵蛋白、受體CD71、CD34及轉(zhuǎn)錄因子P63等。Kaur等［10］的試驗結(jié)果表明，HFSCs表達高水平的β1-integrin。目前比較公認HFSCs標志主要有K19［10］、β1-integrin［11］、CD34［12］，和K15等［13］。

本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離的HFSCs高表達K14，表達率92%，而不表達CD271。本試驗結(jié)果與史明艷等［14］、Inoue等［15］的報道相符。

4 結(jié)論

本研究對綿羊HFSCs的培養(yǎng)進行了嘗試，首次建立了云南半細毛羊HFSCs無血清培養(yǎng)體系，并進行了初步驗證。然而，鑒于目前國內(nèi)外綿羊HFSCs的研究報道相對較少，因此應(yīng)采用更有利的技術(shù)手段，如流式鑒定、誘導(dǎo)分化，來證明所培養(yǎng)的細胞是HFSCs。該項研究對于探討半細毛生長發(fā)育規(guī)律以及成體干細胞增殖分化特性研究具有非常重要的意義。

［1］Paus R，Cotsarelis G.The biology of hair follicles［J］.N Eng J Med，1999，341（7）：491-497.

［2］郭婷婷，張世棟.細毛羊毛囊干細胞分離培養(yǎng)方法比較研究［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（7）：148-152.

［3］史明艷，楊學(xué)義，竇忠英.山羊HFSCs分離培養(yǎng)方法研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2006，37（5）：436-440.

［4］弓慧敏，龐全海.羊駝毛囊干細胞分離培養(yǎng)的研究［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)分會第五屆全體會議第十次學(xué)術(shù)研討會論文集.2009：131-134.

［5］楊婷，陳廣華.無血清和含胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性比較研究［J］.中華血液學(xué)雜志，2012，33（9）：715-719.

［6］符剛，高國強.無血清K-SFM培養(yǎng)條件下大鼠毛囊Bulge細胞生物學(xué)特性的研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2005，27（15）：1538-1540.

［7］張兆遠.濟寧青山羊皮膚毛囊體外培養(yǎng)和基因表達差異研究［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［8］崔志峰，趙晶，王慧，等.不同培養(yǎng)基對山羊毛囊體外培養(yǎng)的影響研究［J］.山東大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2008，43（5）：105-109.

［9］Ma DR，YangE N，Lee ST.Areview：the location，molecular characterisation and multipotencyof hair follicle epidermal stemcell［J］.Anim Acad Med Singapore，2004，33：784-788.

［10］Kaur P，Li A.Adhesive properities of human basal epidermal cells：an analysis of keratinocyte stem cells，transit amplifying cells，and postmitotic differentiatingcells［J］.Invest Dermatol，2000，114（3）：413-420.

［11］Trempus C S，Morris R J，Bortner C D，et al.Enrichment for living murine keratinocytes from the hair follicle bulge with the cell surface marker CD34［J］.Invest Dermatol，2003，120（4）：501-511.

［12］Clausen F，Potten CS.Heterogeneityofkeratinocytes in the epiidermal basal celllayer［J］.Cutan Pathol，1990，17：129-143.

［13］Misago N，Narisaway Y.Cytokeratin 15 expression in apocrine mixed tumors of the skin and other benign neoplasms with apocrine differentiation［J］.Dermatol，2006，33（1）：2-9.

［14］史明艷，高雪，楊學(xué)義，等.山羊毛囊干細胞分離、培養(yǎng)及鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1679-1683.

［15］Inoue K，Aoi N，SatoT，et al.Differential expression ofstem-cell-associated markers in human hair follicle epithelial cells［J］.Laboratory Investigation，2009,89：844-856.

Establishment of Serum Free Culture of Hair Follicle Stem Cell in Yunnan Semi-fine Wool Sheep

LvChun-rong，Quan Guo-bo，HongQiong-hua，et al
（Yunnan AcademyofAnimal and VeterinarySciences，Kunming650224，China）

This experiment was aimed to study the separation，culture and identification methods of hair follicle stem cells（HFSCs）：for the development offurther research on cell differentiation.Method：The tissue piece culture method was used to separate and culture HFSCs.Then the cultured cells were identified by immunohistochemistry.Result：The established HFSCs exhibited adherent growth type，small volume，high nucleus/cytoplasmratio，high refractivityand transparent cell appearance.Immunofluorescence assay indicated that Yunnan semi-fine wool sheep HFSCs expressed K14，not expressed CD271.These results further proved that the cultured cells were indeed HFSCs.Conclusion：A serum free culture system of Yunnan semi-fine wool sheep HFSCs was established using the tissue piece culture method.This study is very important for investigation of the regulation mechanismofdevelopment ofwool follicle and the characterstics of proliferation and differentiation ofHFSCs.

Yunnan semi-fine wool sheep；HFSCs；separation and culture

S826

A

2095-3887（2014）05-0022-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.006

2014-06-04

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項目（2012FD083）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。