丹皮酚對(duì)血管性認(rèn)知障礙小鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用

王浩，耿趙銘，咼登俊，胡智偉，王百辰

（1.浙江省立同德醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310012；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濰坊 261053）

丹皮酚對(duì)血管性認(rèn)知障礙小鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用

王浩1，耿趙銘2，咼登俊1，胡智偉1，王百辰1

（1.浙江省立同德醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，浙江 杭州 310012；2.濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)系，山東 濰坊 261053）

目的：探討丹皮酚對(duì)血管性認(rèn)知障礙（VCI）小鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元損傷的影響。方法：雄性C57BL/6小鼠60只，隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組、模型（VCI）組、丹皮酚（Pae）低、中、高劑量治療組，每組12只。采用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎（2VO）制備小鼠反復(fù)缺血再灌注VCI模型，Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能，尼氏染色觀察小鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化，比色法檢測(cè)海馬SOD活性、MDA和NO含量的變化。結(jié)果：VCI小鼠認(rèn)知功能下降（P＜0.01），海馬CA1區(qū)神經(jīng)元變性壞死，MDA和NO含量增加，SOD活性降低（P＜0.01）；丹皮酚中、高劑量治療可顯著提高VCI小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少VCI所致的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡，并降低MDA和NO含量，升高SOD活性（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)論：丹皮酚可有效增強(qiáng)VCI小鼠的認(rèn)知功能，并改善海馬神經(jīng)元病理改變，可能與其抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

認(rèn)知障礙，血管性；抗氧化；海馬；丹皮酚；小鼠

血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是指各種血管性因素引起的不同程度的認(rèn)知障礙綜合征，發(fā)病率高，起病隱匿并且進(jìn)行性加重，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1-2]。VCI與缺血性腦血管病有關(guān)，長(zhǎng)期慢性腦灌注不足可引起腦組織病理生理改變，進(jìn)而出現(xiàn)系列功能障礙。目前主要是通過(guò)改善循環(huán)、促進(jìn)代謝、增強(qiáng)神經(jīng)傳遞等改善患者癥狀，但仍缺乏特異有效的治療藥物[3]。而中藥及其活性成分在防治腦缺血損傷及認(rèn)知損害等方面顯示出良好效果，成為研究熱點(diǎn)[4]。丹皮酚（paeonol，Pae）是一種中藥單體，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤及抗心律失常等藥理作用[11]。本研究旨在觀察Pae對(duì)VCI小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并初步探討其保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 雄性C57BL/6小鼠60只，體質(zhì)量22～26 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0002868，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2003-0001。隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）組，血管性認(rèn)知障礙模型（VCI）組，Pae低、中、高劑量治療（分別為Pae-L、Pae-M、Pae-H）組，每組12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Pae（Pae注射液：每支10 mg/2 mL，純度99%，由上海第一生化藥業(yè)有限公司提供）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.3 模型建立及給藥方法 采用反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）造成缺血再灌注損傷（2VO）建立小鼠VCI模型[6-7]。采用10%水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠，鈍性分離雙側(cè)CCA，用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)CCA造成腦缺血，夾閉10 min，再灌注20 min，反復(fù)3次，縫合切口，術(shù)后行抗感染治療。Sham組只行CCA分離，不夾閉血管。治療組術(shù)后第1天分別開(kāi)始腹腔注射10、20、40 mg/kg Pae，每日1次，共28 d；而Sham組和VCI組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液注射。模型篩選標(biāo)準(zhǔn)：排除術(shù)后有明顯運(yùn)動(dòng)障礙的小鼠，進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，取第5天逃避潛伏期進(jìn)行計(jì)算，公式為：（測(cè)試小鼠逃避潛伏期-對(duì)照組小鼠平均逃避潛伏期）/測(cè)試小鼠逃避潛伏期，＞20%為癡呆（其中20%～30%為輕度，30%～40%為中度，＞40%為重度），＜20%者剔除。

1.4 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)定

1.4.1 定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前將小鼠放入水中進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。術(shù)后28 d各組小鼠開(kāi)始行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，每天訓(xùn)練1次，記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)的時(shí)間即逃避潛伏期；如果小鼠在120 s內(nèi)未找到平臺(tái)，由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái)，記為120 s。每只小鼠每天分別從4個(gè)不同象限放入水中，每個(gè)象限各放入1次，計(jì)算每天逃避潛伏期的平均值。

1.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：第6天撤除平臺(tái)，任選一個(gè)入水點(diǎn)放入小鼠，測(cè)量120 s內(nèi)：①小鼠在目標(biāo)象限和其他象限的游泳時(shí)間；②穿越目標(biāo)（原平臺(tái)）次數(shù)[8-9]。

1.5 生化指標(biāo)檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，每組6只小鼠斷頭取腦，在冰上迅速分離海馬組織，制成10%組織勻漿，4 ℃ 3 000 r/min，離心10 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，測(cè)定海馬組織SOD活性及MDA和NO的含量。

1.6 病理學(xué)觀察 每組另6只小鼠麻醉后行心臟灌流，冰預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液快速?zèng)_洗后序貫以4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦，4%多聚甲醛后固定24 h，30%蔗糖脫水3 d，腦組織沉底后用冰凍切片包埋劑（OCT）包埋，進(jìn)行冰凍切片（10μm），常規(guī)尼氏染色，在顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較用重復(fù)測(cè)量方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pae對(duì)小鼠認(rèn)知功能的影響

2.1.1 定位航行實(shí)驗(yàn)：隨著訓(xùn)練次數(shù)增多，各組小鼠逃避潛伏期均有不同程度縮短。與Sham組相比，VCI組小鼠的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（P＜0.01）；而與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組小鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（n=12，±s，s）

表1 各組小鼠逃避潛伏期比較（n=12，±s，s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天Sham組32.06±16.8325.32±14.3320.46±10.5613.43±9.35 9.32±3.91 VCI組80.34±21.50a75.14±9.63a71.21±11.59a65.85±7.32a59.56±9.73a Pae-L組60.86±19.6555.21±11.4148.96±12.6140.28±11.5933.21±8.91 Pae-M組45.21±13.58b37.25±11.37b30.49±8.44b23.25±6.41b20.38±7.25b Pae-H組42.85±14.47b30.25±9.86c26.19±9.37c17.85±5.78c13.51±4.66c

2.1.2 空間探索實(shí)驗(yàn)：與Sham組相比，VCI組穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯縮短（P＜0.01），穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組穿越目標(biāo)象限時(shí)間明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

2.2 Pae對(duì)海馬中SOD活性及MDA和NO含量的影響與Sham組相比，VCI組小鼠海馬中SOD活性明顯降低（P＜0.01），MDA和NO含量顯著升高（P＜0.01）。與VCI組相比，Pae-M組、Pae-H組能夠顯著升高小鼠海馬SOD活性，并降低MDA和NO含量（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表3。

2.3 Pae改善小鼠CA1區(qū)海馬神經(jīng)元損傷 Sham組CA1區(qū)海馬錐體神經(jīng)元數(shù)目多，排列整齊且緊密；VCI組小鼠海馬神經(jīng)元呈現(xiàn)出典型的神經(jīng)病理性改變，神經(jīng)元密度顯著減少（P＜0.01），形態(tài)不規(guī)則，著色不均勻，排列稀疏，并且尼氏小體減少或消失。而與VCI組比較，Pae-M組、Pae-H組的海馬神經(jīng)元損傷減輕（P＜0.05或P＜0.01），并且排列較整齊，層次較清楚，尼氏小體尚存在（見(jiàn)圖1和表4）。

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=12，±s）

表2 各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=12，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別穿越目標(biāo)象限時(shí)間（s）穿越平臺(tái)次數(shù)Sham組22.37±9.20a8.35±2.56 VCI組10.75±4.92a2.13±0.96a Pae-L組13.83±5.17a3.69±0.85 Pae-M組17.43±5.95b4.65±1.52b Pae-H組19.37±4.99c6.81±1.63c

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性、MDA和NO含量比較（n=6，±s）

表3 各組小鼠海馬組織SOD活性、MDA和NO含量比較（n=6，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別SOD（U/mg prot）MDA（μmol/g prot）NO（μmol/g prot）Sham組298.26±62.151.38±0.44a8.82±3.22 VCI組190.85±54.33a2.65±0.51a11.95±3.21a Pae-L組202.17±76.322.21±0.92a10.76±4.59 Pae-M組235.89±58.36b1.93±0.85b10.16±2.57b Pae-H組272.71±71.12c1.55±0.62b9.02±2.35b

圖1 Pae對(duì)小鼠海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元損傷的影響（尼氏染色，×400）

表4 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度比較（n=6，±s）

表4 各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度比較（n=6，±s）

與Sham組比：aP＜0.01；與VCI組比：bP＜0.05，cP＜0.01

組別神經(jīng)元密度（×103cells/mm2）Sham組1.28±0.25aVCI組0.57±0.14aPae-L組0.62±0.23aPae-M組0.86±0.29bPae-H組1.02±0.28c

3 討論

反復(fù)腦缺血再灌注以及長(zhǎng)期慢性腦灌注不足是造成VCI的主要原因，而認(rèn)知功能障礙則是其主要的臨床癥狀[1-2]。本研究采用反復(fù)結(jié)扎小鼠雙側(cè)CCA建立VCI模型，腦組織損傷明顯，并造成學(xué)習(xí)記憶障礙，較好地模擬了VCI病程[6-7]。本實(shí)驗(yàn)行為學(xué)結(jié)果顯示，術(shù)后28 d模型組小鼠出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為逃離潛伏期的延長(zhǎng)和在目標(biāo)象限中游泳時(shí)間的縮短以及穿越平臺(tái)次數(shù)的減少。海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu)之一，是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分，對(duì)缺血、低氧非常敏感，也是VCI研究中涉及最多的腦區(qū)之一[5]，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)海馬進(jìn)行尼氏染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞變性、壞死，神經(jīng)元密度降低，進(jìn)一步證明造模成功。

Pae是從毛茛科植物牡丹皮、蘿藦科植物徐長(zhǎng)卿的全草等中提取出的小分子酚類(lèi)單體，呈白色針狀結(jié)晶，是一種天然抗氧化劑，其藥理作用十分廣泛，具有良好的應(yīng)用前景和臨床價(jià)值[11-14]。研究表明Pae能夠通過(guò)清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、增加腦組織血流量、增加側(cè)支循環(huán)、抑制Ca2+超載、抗炎等減輕腦缺血再灌注損傷[16-17]，并且能抑制阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)元凋亡，改善糖尿病大鼠認(rèn)知障礙[18-20]，還能調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥[15]。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)Pae治療后小鼠逃避潛伏期較模型組明顯縮短，在目標(biāo)象限停留時(shí)間以及穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增多，并且抑制海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞變性、壞死，改善神經(jīng)元密度的降低，提示Pae具有改善認(rèn)知功能的作用。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，提示丹皮酚可能具有治療腦疾病的應(yīng)用前景。

VCI與脂質(zhì)過(guò)氧化、氧自由基釋放、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等有關(guān)，多種機(jī)制相互影響、促進(jìn)，加重腦組織損傷，而自由基大量生成是神經(jīng)元損傷的主要因素之一[1-3，10]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pae治療可明顯降低海馬組織MDA、NO含量，提高SOD活性，表明Pae具有清除腦組織自由基，減少脂質(zhì)過(guò)氧化，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。

綜上所述，通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pae治療可明顯改善VCI小鼠的認(rèn)知功能，降低海馬組織MDA、NO含量，提高SOD活性，并且改善海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，其作用機(jī)制可能與減輕海馬區(qū)的氧化應(yīng)激水平有關(guān)。當(dāng)然針對(duì)Pae改善VCI小鼠認(rèn)知功能的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

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（本文編輯：吳飛盈）

Protective effects of paeonol on cognitive dysfunctions in mice with vascular cognitive impairment

WANG Hao1, GENG Zhaoming2, GUO Dengjun1, HU Zhiwei1, WANG Baichen1.
1.Department of Neurology, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou, 310012; 2.Department of Clinical Medicine, Weifang Medical College, Weifang, 261053

Objective:To investigate the effects of paeonol on cognitive dysfunctions and hippocampal neuronal injury of vascular cognitive impairment (VCI) mice.Methods:Sixty C57BL/6 mice were randomly divided into sham opertated group, the VCI group and the paeonol treated groups (low, medium and high dose). The VCI models were dupilicated by the bilateral common carotid artery occlusion (2VO). The cognitive impairments were observed by Morris water maze. The contents of MDA, SOD and NO in hippocampus were determined spectrometrically. The hippocampal neuron injuries in the CA1 region were detected by nissle staining.Results:VCI induced the decreased cognitive function and neuron injury in the hippocampal CA1 region (P＜0.01). And MDA and NO contents were signifcantly increased, whereas SOD activity was dramatically decreased after VCI (P＜0.01). Compared with VCI model goup, the medium and high dose of paeonol treatment signifcantly improved cognitive impairments and reduced pathological changes in hippocampal CA1 region (P＜0.05, P＜0.01). In additon, the medium and high dose of paeonol treatment markedly improved SOD activity, decreased MDA and NO contents in hippocampus (P＜0.05, P＜0.01).Conclusion:Paeonol can improve cognitive impairments and neuronal injury in VCI mice, which may be related to the increased antioxidative ability of brain tissue.

cognitive impairment, vascular; antioxidant; hippocampus; paeonol; mice

R741

A

1000-2138（2014）10-0708-04

2014-04-09

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110679）。

王浩（1982-），男，山東棗莊人，主治醫(yī)師，碩士。

胡智偉，主任醫(yī)師，Email：huzhiwei2008@163.com。