藏羊AMPK、ACC和GS酶活分布及饑餓應(yīng)激對(duì)其酶活的影響

商振達(dá)，李長(zhǎng)忠，毛學(xué)榮

（青海大學(xué)，西寧 810016）

繁殖與生理

藏羊AMPK、ACC和GS酶活分布及饑餓應(yīng)激對(duì)其酶活的影響

商振達(dá)，李長(zhǎng)忠，毛學(xué)榮

（青海大學(xué)，西寧 810016）

為分析AMPK等酶對(duì)機(jī)體代謝的影響，采用酶聯(lián)免疫分析法（ELISA），分別測(cè)定正常飼養(yǎng)和饑餓48 h后藏羊各組織的AMPK、ACC和GS的活性。結(jié)果表明：AMPK、ACC和GS分布于藏系綿羊各組織中，且各組織器官中3種酶活性差異顯著（P<0.05）；饑餓應(yīng)激導(dǎo)致骨骼肌、肝臟、腎臟和小腸組織中AMPK活性升高，骨骼肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和小腸組織中ACC活性下降，骨骼肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和小腸組織中GS活性下降。因此，AMPK、ACC和GS在藏系綿羊的各組織器官中分布廣泛；饑餓應(yīng)激可能通過激活A(yù)MPK表達(dá)，下調(diào)ACC和GS表達(dá)而調(diào)節(jié)藏羊的應(yīng)激代謝。

藏系綿羊；AMPK；ACC；GS；饑餓應(yīng)激

藏羊在我國(guó)青藏高原及與其毗鄰的川、滇、甘等高寒地區(qū)均有分布，是經(jīng)過長(zhǎng)期自然和人工選擇形成的品種。由于生活環(huán)境的復(fù)雜性，藏系綿羊形成了體格大、體質(zhì)結(jié)實(shí)、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性好等的特點(diǎn)［1］。此外，藏羊肉具有高蛋白、高能量、低膽固醇的特點(diǎn)［2］。

一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是一種AMP激活蛋白激酶［3］，是由α、β和γ亞基組成的異源三聚體酶［4-5］，在動(dòng)物應(yīng)激過程中起重要作用［6］。乙酰輔酶A（ACC）屬于生物素包含酶類型Ⅰ，催化脂肪酸的代謝途徑中乙酰輔酶A生成丙二酸輔酶A這一關(guān)鍵步驟［7-9］。糖原合成酶（GS）是糖原合成關(guān)鍵酶，有磷酸化的非活性型糖原合成酶D和脫磷酸形成的活性型糖原合成酶兩種形式［10］。AMPK、ACC以及GS間存在密切聯(lián)系。AMPK可以通過磷酸化GS的Ser7和磷酸化ACC，使GS和ACC失活，從而抑制糖原和脂肪酸合成，降低ATP消耗，促進(jìn)ATP生成［11-12］。因此，分析藏系綿羊體內(nèi)AMPK、ACC和GS三種酶的酶活分布以及饑餓應(yīng)激對(duì)宰AMPK、ACC和GS活性的影響，可為探討AMPK活性變

化對(duì)ACC、GS活性的影響，從而為分析AMPK對(duì)機(jī)體代謝的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 從青海省剛察縣一屠宰場(chǎng)選取營(yíng)養(yǎng)狀況相同的6只藏羊，分成兩組，即正常飼養(yǎng)和饑餓48 h的試驗(yàn)組，每組各3只。

1.1.2 樣品采集與處理

1.1.2.1 組織的采集與處理 將藏羊屠宰后迅速取其骨骼肌、心肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和小腸組織，液氮保存（-180℃），以制備組織勻漿，提取酶液用。

1.1.2.2 組織勻漿的制備和酶液提取 參照Underwood等（2008）的方法，取冷凍的各組織器官，在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱取0.1～0.5 g磨碎，放入預(yù)冷的離心管中，加入0.5～2.5 mL冰的勻漿液勻漿（整個(gè)過程需要在冰浴中進(jìn)行），然后在13 000 g、4℃下離心5 min，得到上清液置于-80℃冰箱中保存，用于AMPK、ACC和GS活性的測(cè)定。

勻漿液成分為：甘露醇0.25mol/L，Tris/HCl 0.05mol/L，EDTA 1 mmol/L，EGTA 1 mmol/L，DTT 1 mmol/L，NaF 50 mmol/L，焦磷酸鈉5 mmol/L。

1.2 方法

1.2.1 AMPK活性測(cè)定 使用美國(guó)rapidbio公司生產(chǎn)的綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行測(cè)定。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶濃度。

1.2.2 ACC和GS活性測(cè)定方法 分別使用美國(guó)rapidbio公司生產(chǎn)的綿羊乙酰輔酶A羧化酶（ACC）酶聯(lián)免疫分析試劑盒和綿羊糖原合成酶（GS）酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在進(jìn)行正常藏羊各組織分析時(shí)，采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常生理?xiàng)l件下藏羊體內(nèi)3種酶活分布

2.1.1 AMPK酶活 從表1可以看出，肺臟中AMPK活性最高，腎臟、脾臟和骨骼肌中AMPK活性較高，而心肌和小腸中的AMPK活性較低，肝臟中AMPK活性最低。各組織器官中AMPK活性總體差異顯著（P<0.05）。

2.1.2 ACC酶活 從表1可見，腎臟和小腸中ACC活性最高，脾臟和肝臟中ACC活性較高，而骨骼肌和肺臟中ACC活性較低，心肌中ACC活性最低。各組織器官中ACC活性總體差異顯著（P<0.05）。

2.1.3 GS酶活 從表1可見，肝臟和腎臟中GS活性最高，脾臟、骨骼肌和小腸中GS活性較高，而心肌中的GS活性較低，肺臟中GS活性最低。各組織器官中GS活性總體差異顯著（P<0.05）。

表1 藏羊體內(nèi)3種酶活分布

2.2 饑餓應(yīng)激對(duì)藏羊各組織器官3種酶活的影響

2.2.1 AMPK酶活 由表2、表3可知，饑餓應(yīng)激對(duì)藏系綿羊各組織器官AMPK酶活有不同程度的影響。與正常藏羊相應(yīng)組織器官相比，饑餓應(yīng)激對(duì)藏羊小腸AMPK活性影響最大，酶活升高了45.1%；其次是骨骼肌和腎臟，分別升高了23.4%和21.1%；對(duì)肝臟活性影響較小，只升高了14.3%；對(duì)心肌和脾臟AMPK活性無(wú)影響。而肺臟AMPK活性則下降。

2.2.2 ACC酶活 從表2、表3可見，與正常飼養(yǎng)藏羊相比，饑餓應(yīng)激使藏羊肺臟ACC活性下降50.9%；其次是腎臟和骨骼肌，分別下降44.2%和43.4%；對(duì)小腸和肝臟ACC活性影響較小，分別下降22.5%和20.1%；對(duì)脾臟ACC活性影響最小，只下降17.1%；心肌ACC活性反而升高。

2.2.3 GS酶活 從表2、表3可見，肺臟和骨骼肌GS活性變化最大，饑餓應(yīng)激使其分別下降73.8%和73.4%；其次是肝臟，下降37.6%；小腸和腎臟活性變化較小，分別下降21.9%和20.9%；脾臟GS活性變化最小，只下降10.0%，而心肌GS活性無(wú)變化。

表2 饑餓應(yīng)激對(duì)藏羊各組織器官3種酶活影響

表3 與對(duì)照組相比AMPK、ACC和GS活性變化%

2.3 AMPK活性變化對(duì)相應(yīng)組織器官ACC和GS活性的影響

分析結(jié)果顯示，在骨骼肌、肝臟、腎臟和小腸中，饑餓應(yīng)激引起AMPK活性變化與ACC和GS活性變化呈負(fù)相關(guān)。而在心肌、脾臟和肺臟中，3種酶活變化沒有相關(guān)性。

3 討論

AMPK、ACC、GS三種酶活是反映機(jī)體代謝的主要指標(biāo)。余冰［13］研究結(jié)果表明，仔豬體內(nèi)骨骼肌AMPK活性最高，肝臟中活性最低。秦玉輝［14］報(bào)道，蛋雞體內(nèi)骨骼肌和心肌中AMPK活性較高，肝臟中活性最低。本研究對(duì)藏羊體內(nèi)酶活進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果與余冰［13］對(duì)豬仔和秦玉輝［14］對(duì)蛋雞的研究結(jié)果相似。藏羊各組織中肺臟、腎臟和脾臟中AMPK酶活最高，這可能與組織器官功能有關(guān)。肺臟呼吸時(shí)不停地收縮和舒張，腎臟排泄體內(nèi)代謝廢物，而脾臟過濾和儲(chǔ)存血液，這些生理過程中均需要大量能量，導(dǎo)致AMPK不斷被活化。饑餓應(yīng)激使藏羊骨骼肌、肝臟、腎臟和小腸組織中的AMPK活性升高，肺臟AMPK活性下降，而對(duì)心肌和脾臟AMPK活性無(wú)顯著影響，可能是機(jī)體適應(yīng)饑餓的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)藏羊腎臟ACC酶活最高，脾臟和肝臟ACC酶活較高，而心肌ACC酶活最低，這可能與組織結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)。腎臟的腎竇含有脂肪組織，脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量淋巴細(xì)胞，而淋巴細(xì)胞具有運(yùn)輸脂肪的功能，而肝臟能將脂肪與磷酸及膽堿結(jié)合，轉(zhuǎn)變成磷脂，轉(zhuǎn)運(yùn)到體內(nèi)其他部位。饑餓應(yīng)激使藏羊骨骼肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和小腸組織ACC活性下降，而使心肌ACC活性上升，均反映了藏羊?qū)︷囸I的適應(yīng)性反應(yīng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)肝臟中GS活性最高，腎臟和脾臟GS活性較高，而肺臟中GS活性最低。這也許與各組織中糖原含量及與糖原合成不同有關(guān)。肝臟是機(jī)體內(nèi)儲(chǔ)存糖原的主要器官。饑餓應(yīng)激使藏羊骨骼肌、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和小腸組織GS活性下降，而對(duì)心肌組織中GS活性沒有顯著影響，說明糖代謝對(duì)心臟功能的重要性。

綜上所述，AMPK、ACC和GS三種酶在藏系綿羊體內(nèi)廣泛存在，饑餓應(yīng)激使藏系綿羊體內(nèi)的ATP含量下降，AMP含量升高，而AMP是AMPK的激活劑，因此饑餓應(yīng)激會(huì)激活A(yù)MPK，而AMPK可以通過磷酸化作用，使ACC和GS失活，進(jìn)而抑制糖原和脂肪酸的合成來(lái)阻止ATP的消耗。所以，動(dòng)物可以通過AMPK活性的變化來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的應(yīng)激代謝。

［1］劉海珍，焦銷路，范濤.青海藏羊肉的品質(zhì)特性研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2005，25（4）：57-58.

［2］王永等.草地藏系綿羊羊肉品質(zhì)特性研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（10）：111-114.

［3］Shen QW，Gerrard DE，Du M.Compound C，an inhibitor of AMP-activated protein kinase，inhibits glycolysis in mouse longissimus dorsi postmortem［J］.Meat Science，2008，78：323-330.

［4］HardieDG.AMP-activatedproteinkinase：Akeysystemmediatingmetabolic responses to exercise［J］.Medicine and Science in Sports and Exercise，2004，36（1）：28-34.

［5］Shen Q W，Means W J，Thompson S A，et al.Pre-slaughter transport，AMP-activatedproteinkinase，glycolysis，andqualityofporkloin［J］.Meat Science，2006，74：388-395.

［6］Park S H，Gammon S R，Knippers J D，et al.Phosphorylation-activity relationships ofAMPKand acety-l CoAcarboxylase in muscle［J］.J Appl Physiol，2002，92：2475-2482.

［7］Herbert D，Walker K A，Price L J，et al.Acetyl-CoA carboxylase-a graminicide target site［J］.Pestic Sci，1997，50：67-71.

［8］韓春春，王繼文，魏守海.乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的結(jié)構(gòu)與功能［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（3）：413-414，416.

［9］龔瑩，彭少丹，王騫.乙酰輔酶A羧化酶的結(jié)構(gòu)·功能及基因的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：19893-19896.

［10］Guinovart J J，Salavert A，Massague J，et al.Glycogen synthase：A new activity ratio assay expressing a high sensitivity to the phosphorylation state［J］.FEBSLett，1979，106：284-288.

［11］Carling D，Hardie D G.The substrate and sequence specificity of the AMP-activated protein kinase.Phosphorylation ofglycogen synthase and phosphorylase kinase［J］.Biochemica et BioPhysics Acta，1989，1012（1）：81-86.

［12］Chen ZP，McConell BJ.AMPKsignalingin contractinghuman skeletal muscle：acetyl-CoA carboxylase and NO synthase phosphorylation［J］. AmericanJournalofPhysiology，EndocrinologyandMetabolism，2000，279（5）：E1202-1206.

［13］余冰.AMPK對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下仔豬脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［14］秦玉輝.蛋雞體內(nèi)AMPK酶活分布及應(yīng)激對(duì)AMPK酶活影響研究［D］.雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

Distribution of AMPK，ACC and GS Enzyme Activity and the Fast Effects in the Tibetan Sheep

Shang Zhen-da，Li Chang-zhong，MaoXue-rong
（Qinhai University，Xining 810016，China）

For analyzing the AMPK and other enzymes effect on metabolism，using enzyme-linked immunoassay（ELISA），the AMPK,ACCand GSactivityin everyorgans ofTibetan sheep after normal breedingand fast for 48 h were determined.The results showed that AMPK,ACC and GS distributed in every organs of Tibetan sheep,significant difference was found in three kinds of enzyme activity（P<0.05）；fast could increase AMPK activity in the skeletal muscle,liver,kidney and intestine tissues；decrease ACC activity in the skeletal muscle,liver,spleen,lung,kidney and intestine tissues；decrease GS activity in the skeletal muscle, liver,spleen,lung,kidneyand intestine tissues.So,AMPK,ACCand GSdistributed in the organs ofTibetan sheep extensively；fast might activate AMPKexpression and reduce ACCand GSexpression toadjust the stress metabolismofTibetan sheep.

Tibetan sheep；fast；AMPK；ACC；GS

S826.1

A

2095-3887（2014）01-0023-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.01.006

2013-11-04

國(guó)家科技部科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010-GA-870011）

商振達(dá)（1988-），男，碩士研究生。

毛學(xué)榮（1966-）。Email:mkymxr@163.com