殼聚糖澄清葛根提取液的工藝優(yōu)化

吳湛霞，楊錫洪，李思東，劉莉莉，陳曉琪（.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

殼聚糖澄清葛根提取液的工藝優(yōu)化

吳湛霞1，楊錫洪2，*，李思東1，劉莉莉1，陳曉琪1
（1.廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088）

以葛根黃酮轉(zhuǎn)移率、提取液透光率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化，探討了殼聚糖對(duì)葛根提取液澄清作用的影響。結(jié)果表明，殼聚糖用于澄清葛根提取液的最佳工藝條件為：殼聚糖分子量為400ku，殼聚糖用量為0.16g/100mL，溫度為60℃，pH為5.5。在此條件下，黃酮轉(zhuǎn)移率為73.25%，葛根澄清液透光率為97.9%，殼聚糖澄清葛根提取液的效果較好，葛根的有效成分也得到較好的保留。

葛根提取液，殼聚糖，黃酮，澄清

葛根為野葛的干燥根，是常用中藥材，具有退熱止瀉等功效，在保健品中它可緩解頭痛、泄瀉、高血壓等癥狀[1-3]。葛根的活性成分有如下幾類：異黃酮類，主要包括葛根素、大豆苷等；葛根苷類，主要包括葛根苷A、B、C 3種；三萜皂苷類；生物堿及其他化合物。近代藥理研究中最受關(guān)注的是葛根素等異黃酮類活性成分，其制劑對(duì)頭痛、高血壓、腹瀉等疾患療效顯著[4-9]。異黃酮類物質(zhì)作為葛根的主要活性成分，其保健功能也逐漸為人們所認(rèn)可。近年來(lái)，各種葛根制劑及葛根功能飲料不斷被開發(fā)研制[10]，如何優(yōu)化葛根提取液澄清工藝成為研究的主攻方向。目前對(duì)葛根提取液進(jìn)行澄清的經(jīng)典方法是醇沉法，但已有報(bào)道指出將乙醇作為澄清劑有諸多不合理性，如將不溶于醇的無(wú)機(jī)物作為雜質(zhì)除去不夠妥當(dāng)，且具有生物活性及免疫作用的蛋白質(zhì)、多糖也極易被醇沉除去。此外，醇沉工藝耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，成品中殘存的乙醇可能對(duì)藥效有一定影響[11]。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)天然高分子絮凝劑的研究開發(fā)產(chǎn)生了濃厚興趣，淀粉改性陽(yáng)離子絮凝劑、殼聚糖衍生物、木質(zhì)素改性絮凝劑等逐漸成為新的研究熱點(diǎn)[12]。其中殼聚糖澄清劑因資源豐富、成本低、使用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)倍受關(guān)注。殼聚糖絮凝法用于中藥制劑澄清工藝的研究已有報(bào)道[13]，但其用于澄清葛根提取液還少見報(bào)道。本文以葛根為原料，對(duì)殼聚糖澄清葛根提取液的工藝條件進(jìn)行探討，并得出殼聚糖澄清葛根提取液的最佳工藝，為工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

400ku分子量殼聚糖、700ku分子量殼聚糖、3～5ku分子量殼聚糖 廉江市臺(tái)興海洋生物科技有限公司；葛根塊 湛江市鴻中藥店霞山分店；95%乙醇、冰醋酸、無(wú)水乙醇 分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司；鹽酸 分析純，廣州化學(xué)試劑二廠；葛根素對(duì)照品 純度99%，上海廣銳生物科技有限公司。

HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠；PHS-25型pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；UV-5500型紫外可見分光光度計(jì) 上海分析儀器有限公司；UV 1800PC型紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SHB型循環(huán)式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞萊生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葛根提取液的制備 稱取一定量葛根塊，加入30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液加熱回流提取兩次：第一次乙醇添加量為葛根質(zhì)量的6倍，提取時(shí)間為2h；第二次乙醇添加量為葛根質(zhì)量的4倍，提取時(shí)間為1h，然后將兩次提取液合并，過(guò)濾備用。

1.2.2 葛根提取液黃酮含量的測(cè)定 對(duì)照樣溶液的制備：準(zhǔn)確稱取80℃干燥至恒重的葛根素對(duì)照品5.0mg于容量瓶（25mL）中，添加30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇水溶液，溶解定容后放置備用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按照分光光度法（中國(guó)藥典2010年版一部附錄VA）在250nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

待測(cè)液含量測(cè)定：取1.00mL待測(cè)液于50mL容量瓶中，用30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液定容，以30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液作空白對(duì)照，在250nm的波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，得待測(cè)液含量。

1.2.3 葛根提取液透光率的測(cè)定 取待測(cè)液適量，以蒸餾水為空白，于600nm最佳波長(zhǎng)下測(cè)定透光率，透光率的大小間接反映待測(cè)液的澄清度，透光率越大，澄清度越好。

1.2.4 澄清前葛根提取液黃酮含量及透光率的測(cè)定 取1.00mL葛根提取液于50mL容量瓶中，用30%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液定容，測(cè)定其吸光度，計(jì)算其黃酮含量及透光率。

1.2.5 殼聚糖澄清葛根提取液的工藝 殼聚糖澄清劑的制備：用1%（體積分?jǐn)?shù)）的乙酸溶液為溶劑配制1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的殼聚糖溶液，室溫完全溶解后立即使用，以防殼聚糖在稀酸中緩慢水解而影響絮凝效果。

黃酮轉(zhuǎn)移率的計(jì)算：葛根提取液經(jīng)殼聚糖或乙醇澄清，澄清后的葛根提取液中黃酮含量與澄清前葛根提取液中黃酮含量的比值。

1.2.5.1 單因素實(shí)驗(yàn) 殼聚糖用量對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響：準(zhǔn)確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，調(diào)節(jié)pH為5.0，在60℃下水浴攪拌，并依次加入2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL的1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）殼聚糖乙酸溶液，即殼聚糖用量分別為0.08、0.12、0.16、0.20、0.24g/100mL（殼聚糖用量表示為每100mL葛根提取液中殼聚糖的加入量（g））。低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷卻至室溫，靜置24h后過(guò)濾，取上清液，測(cè)定透光率及吸光度。

提取液pH對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響：準(zhǔn)確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，分別調(diào)節(jié)pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，60℃水浴攪拌下加入4.00mL的1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）殼聚糖乙酸溶液，即殼聚糖用量為0.16g/100mL，低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷至室溫，靜置24h，過(guò)濾，取上清液，測(cè)定透光率及吸光度。

提取液溫度對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響：準(zhǔn)確移取25.00mL提取液于50mL具塞比色管中，調(diào)節(jié)pH為4.0，分別在30、40、50、60、70℃條件下水浴，加入4.00mL的1%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）殼聚糖溶液，即殼聚糖用量為0.16g/100mL，低速攪拌2min，絮凝30min后，自然冷至室溫，靜置24h后過(guò)濾，取上清液，測(cè)定透光率及吸光度。

1.2.5.2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 由上述單因素實(shí)驗(yàn)得出殼聚糖用量、pH和提取液溫度的3個(gè)水平，建立因素水平表（見表1），以葛根溶液透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)確定最佳殼聚糖用量、pH和提取液溫度。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 殼聚糖分子量與提取液透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的關(guān)系 取提取液25.00mL，分別在最優(yōu)條件下加入最佳用量的分子量（M）分別為400、700、3～5ku殼聚糖，靜置24h后過(guò)濾，取上清液測(cè)定葛根黃酮含量及透光率，計(jì)算黃酮轉(zhuǎn)移率。

1.2.7 殼聚糖澄清葛根提取液與傳統(tǒng)工藝比較 取葛根提取液25.00mL，添加95%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇配制成70%（質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)）的待測(cè)溶液，攪拌，靜置24h待醇沉后過(guò)濾，將上清液濃縮至25.00mL，測(cè)定其葛根黃酮含量和透光率，計(jì)算黃酮轉(zhuǎn)移率。

取葛根提取液25.00mL，在殼聚糖澄清工藝優(yōu)化后得出的最佳條件下澄清，靜置24h后過(guò)濾，取上清液測(cè)定葛根黃酮的含量及透光率，計(jì)算黃酮轉(zhuǎn)移率。

圖1 黃酮濃度對(duì)吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of concentration of flavonoid and the absorbance

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根溶液黃酮含量的測(cè)定

采用分光光度法在250nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，其線性關(guān)系見圖1。以黃酮濃度（C）對(duì)吸光度（A）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=0.0777C+0.0243（相關(guān)系數(shù)R2=0.999），即為提取液黃酮含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1可知，黃酮濃度在4.00～11.0μg/mL范圍內(nèi)其濃度值與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.2 澄清前葛根提取液黃酮含量和透光率的測(cè)定

用紫外分光光度法測(cè)得澄清葛根提取液的透光率為24.7%，吸光度為0.671，換算得澄清前葛根提取液黃酮含量為416.2μg/mL。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 殼聚糖用量對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響 如圖2所示，隨著殼聚糖用量的增加，葛根提取液的黃酮轉(zhuǎn)移率逐漸降低，透光率逐漸增大。說(shuō)明隨著殼聚糖用量的增加，葛根提取液澄清度逐漸升高，而葛根提取液有效成分卻逐漸減少。在0.16～0.24g/100mL時(shí)，隨著殼聚糖用量的增高，透光率升高不太明顯，而黃酮轉(zhuǎn)移率卻大幅度降低，所以0.16g/100mL為最佳用量。當(dāng)殼聚糖用量大于0.16g/100mL時(shí)，葛根提取液的澄清效果較好，而葛根黃酮轉(zhuǎn)移率卻降低?？赡艿脑蚴牵弘S著殼聚糖用量的增加，吸附架橋和電中和作用增強(qiáng)，澄清效果逐漸增強(qiáng)，另外殼聚糖可能會(huì)影響提取液中黃酮的穩(wěn)定性，與蛋白質(zhì)、鞣酸等大分子物質(zhì)同時(shí)沉降，導(dǎo)致黃酮的含量呈飽和性而降低。酮的轉(zhuǎn)移影響較大。當(dāng)pH為4時(shí)，有效成分黃酮的轉(zhuǎn)移率較高，大于70%；綜合考慮澄清效果，此pH條件下澄清后的提取液透光率也較高，即可選為較合適的pH?？赡艿脑蚴请S著pH降低，蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)等大分子也帶正電荷，使殼聚糖的陽(yáng)離子型澄清作用逐漸減弱，澄清效果變差。

圖2 殼聚糖用量對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響Fig.2 Effect of amount of chitosan on the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.3.2 提取液pH與透光率及黃酮轉(zhuǎn)移率的關(guān)系 由圖3可知，隨著pH的增加，葛根黃酮的轉(zhuǎn)移率先下降后上升，而透光率一直呈上升趨勢(shì)。說(shuō)明pH對(duì)葛根黃

圖3 提取液pH與透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的關(guān)系Fig.3 Relationship of pH of extracting solution with the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.3.3 提取液溫度對(duì)透光率及黃酮轉(zhuǎn)移率的影響 如圖4所示，在提取液溫度為30～50℃范圍內(nèi)，隨著提取液溫度的升高，黃酮轉(zhuǎn)移率及透光率均呈上升趨勢(shì)；而在50～70℃范圍內(nèi)，隨著提取液溫度的升高，黃酮轉(zhuǎn)移率及透光率均呈下降趨勢(shì)。說(shuō)明提取液溫度為50℃時(shí)，葛根澄清度和黃酮轉(zhuǎn)移率最佳。隨著溫度的升高，澄清效果有所改善，但溫度過(guò)高會(huì)出現(xiàn)澄清效果變差的現(xiàn)象，且黃酮含量也逐漸減低。原因可能是高溫使溶液黏性降低，粒子熱運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，從而使架橋澄清作用減弱。

圖4 提取液溫度對(duì)透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的影響Fig.4 Effect of temperature of extracting solution on the transport rate of flavonoid and the light transmittance

2.4 殼聚糖澄清工藝的優(yōu)化

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2，用殼聚糖澄清葛根提取液過(guò)程中，考慮到黃酮轉(zhuǎn)移率和提取液透光率是研究殼聚糖澄清效果的兩個(gè)指標(biāo)，在盡可能保持較高黃酮轉(zhuǎn)移率的條件下，透光率越大越好。所以對(duì)黃酮轉(zhuǎn)移率和透光率這兩個(gè)指標(biāo)分別賦予權(quán)重，再進(jìn)一步進(jìn)行極差分析，結(jié)果見表3。賦予黃酮轉(zhuǎn)移率和透光率的權(quán)重分別為0.8和0.2，在這個(gè)基礎(chǔ)上再進(jìn)行極差分析，從而獲得最佳的澄清工藝條件。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 L9（34）Design and results of orthogonal experiment

從表3中可以看出，影響殼聚糖澄清葛根提取液的效果的因素主次順序是C＞B＞A，即提取液溫度對(duì)澄清效果的影響最大，其次是提取液的pH，最后為殼聚糖用量，確定的最優(yōu)方案為A2B3C3。由正交實(shí)驗(yàn)可得最佳工藝條件為：殼聚糖用量是0.16g/100mL，pH是5.5，提取液溫度是60℃。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得出黃酮轉(zhuǎn)移率為73.25%，葛根澄清液透光率為97.9%。殼聚糖澄清葛根提取液的工藝簡(jiǎn)單且澄清效果很好，對(duì)葛根的有效成分也有較好的保留作用。

表3 極差分析Table 3 Range analysis

2.5 殼聚糖分子量與葛根提取液透光率和黃酮轉(zhuǎn)移率的關(guān)系

如表4所示，同一澄清工藝條件，不同分子量殼聚糖對(duì)葛根提取液的澄清效果差別較大。當(dāng)殼聚糖分子量為400ku時(shí)，澄清效果最好，透光率高達(dá)97.9%，而當(dāng)分子量為700ku時(shí)，澄清液較混濁，透光率只有81.4%，而選用分子量為3～5ku的殼聚糖時(shí)，澄清效果較差且黏糊難以過(guò)濾，但葛根黃酮轉(zhuǎn)移率較高。因此上述討論的殼聚糖最優(yōu)澄清工藝只適用于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為400ku的殼聚糖。

表4 最優(yōu)條件下不同分子量殼聚糖的澄清效果比較Table 4 Comparison of the clarification effect by chitosan with different molecular weight on the optimal conditions

2.6 殼聚糖澄清法與醇沉法的比較

表5為葛根提取液經(jīng)澄清法與醇沉法過(guò)濾后的黃酮轉(zhuǎn)移率及透光率。由表5可得，醇沉法澄清葛根提取液的黃酮轉(zhuǎn)移率較高，高達(dá)89.72%，而澄清度比殼聚糖澄清時(shí)差，透光率只有82.3%。殼聚糖（分子量為400ku）澄清效果與醇沉效果相比，殼聚糖澄清效果較好，而葛根黃酮的轉(zhuǎn)移率相對(duì)偏低。

表5 最優(yōu)條件下殼聚糖澄清法與醇沉法的澄清效果比較Table 5 Comparison of the clarification effect by chitosan and alcohol on the optimal conditions

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)以葛根黃酮轉(zhuǎn)移率、提取液透光率為指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)澄清工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝條件即殼聚糖用量是0.16g/100mL，提取液pH為5.5，提取液溫度是60℃時(shí)，澄清效果最好。在此條件下黃酮轉(zhuǎn)移率為73.25%，葛根澄清液透光率高達(dá)97.9%。殼聚糖澄清葛根提取液的工藝簡(jiǎn)單，成本低廉，且澄清效果很好，葛根的有效成分也能得到較大程度的保留，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論可為工業(yè)化應(yīng)用提供參考。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典Ⅰ部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：233-234.

[2]楊鵬，李秀蘭，賈雪嶺.葛根素的藥理作用和臨床應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2013，28（2）：226-227.

[3]李譽(yù)海，劉愛芬，孫慧博.葛根素治療冠心病的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)療前沿，2013，8（13）：10-11.

[4]周吉銀，周世文.葛根總黃酮及葛根素解酒的藥理研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27（9）：1280-1282.

[5]尹麗紅，李艷楓，孟繁琳.葛根的化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用[J].黑龍江醫(yī)藥，2010，23（3）：371-372.

[6]趙淑芹.葛根的藥理作用與臨床應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2013，3（2）：40-43.

[7]徐立，趙媛，欒玉泉，等.葛根不同部位中葛根素含量研究[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8（10）：3-6.

[8]徐軼爾，李秋紅，楊菲菲.中藥葛根的藥理藥效研究[J].吉林中醫(yī)藥，2010，30（11）：993-994.

[9]謝明亮，王位萍.葛根的藥理作用和臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中醫(yī)中藥，2011，19（6）：329.

[10]羅志強(qiáng)，孫術(shù)國(guó)，王小虎，等.葛根保健飲品研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程技術(shù)，2009（10）：37-40.

[11]馬依努爾·拜克力，吳桂榮.吸附澄清劑在純化中藥制劑中的應(yīng)用[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，30（3）：215-216.

[12]Pal S，Mal D，Singh R P.Cationic starch：an effective flocculating agent[J].Carbohydrate Polymer，2005，59：417-423.

[13]商常發(fā)，李慶林，何領(lǐng).殼聚糖絮凝法在澄清中藥水提液中的應(yīng)用[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2006，13（5）：365-366.

Optimization of clarification process of extracting solution from Radix Puerariae with chitosan

WU Zhan-xia1，YANG Xi-hong2，*，LI Si-dong1，LIU Li-li1，CHEN Xiao-qi1
（1.College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China；2.College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The optimum condition of clarification process of extracting solution from Radix Puerariae with chitosan was investigated using single factor experiment and orthogonal experiment with the transport rate of flavonoid and the light transmittance of extracting solution as indexes.The optimum conditions of flocculation were as follows：the clarification temperature was 60℃，the amount of chitosan with molecular weight of 400ku was 0.16g/100mL（the content of chitosan per 100mL of extracting solution from Radix Puerariae）and the pH value was 5.5.Under this condition，the transport rate of flavonoid was 73.25%，and the light transmittance was 97.9%.The clarification technology by chitosan had good effect on the extracting solution from Radix Puerariae，in addition，the effective component of Radix Puerariae was well preserved.

extracting solution from Radix Puerariae；chitosan；flavonoid；clarification

TS201.1

B

1002-0306（2014）14-0268-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.051

2013－10－12 *通訊聯(lián)系人

吳湛霞（1967-），女，大專，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：海洋應(yīng)用化學(xué)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31271938）。