酶-超聲波聯(lián)用提取紫薯色素的工藝研究

李 輝，孟雅紅，付彥青，孫麗平，彭林才（1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南昆明650500；.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650500）

酶-超聲波聯(lián)用提取紫薯色素的工藝研究

李 輝1，2，孟雅紅1，2，付彥青1，2，孫麗平1，2，彭林才2
（1.昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院，云南昆明650500；2.昆明理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，云南昆明650500）

研究了酶-超聲波聯(lián)用提取紫薯色素的工藝條件，通過單因素和L9（34）正交實(shí)驗(yàn)確定了其最佳提取工藝條件為：纖維素酶用量20IU/g，酶解時(shí)間45min，酶解溫度50℃，酶解pH5.6，料液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間20min，超聲溫度60℃。在最佳提取工藝條件下，最佳提取次數(shù)為三次時(shí)，紫薯色素的提取率可達(dá)98.7%。同時(shí)對(duì)比了酶法、超聲法、酶-超聲聯(lián)用法三種提取方法，結(jié)果表明酶-超聲波聯(lián)用法的紫薯色素提取率較酶法、超聲法分別提高了39.3%和20.3%。研究表明酶-超聲波聯(lián)用法能更好地提取紫薯色素，為紫薯色素的提取提供了一種新工藝。

紫薯，紫薯色素，纖維素酶，超聲波

隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，對(duì)食用色素的選取有了新的趨向[1]。天然色素以其安全、綠色、無毒性，同時(shí)兼具營養(yǎng)和藥理等保健功能等優(yōu)點(diǎn)而日益受到人們的重視[2-3]。因此，尋求和開發(fā)天然色素對(duì)于保障人類健康，促進(jìn)食品工業(yè)的發(fā)展具有十分重要的意義。紫薯（purple sweet potato），又名黑薯，薯肉呈紫色至深紫色，它除了具有普通紅薯的營養(yǎng)成分外，還富含硒元素和花青素[4]。紫薯色素是從紫薯中提取的具有良好生物活性的水溶性紅色素，屬于天然花青素類色素，存在于紫薯的塊根、莖、葉和薯皮中[5-6]。在自然狀態(tài)下，花青素在植物體內(nèi)常與各種單糖結(jié)合形成糖苷，稱為花色苷（anthocyanin）。紫薯色素不僅具有給食品著色的作用，而且還具有抗氧化、抗突變、減輕肝機(jī)能障礙與心血管疾病等作用[7]，是一類極具前途的功能型食品添加劑和保健食品基料。目前，對(duì)紫薯色素的提取方法有溶劑法[8]、微波提取法[9-10]、超聲提取法[11]、酶-微波提取法[12]等，而采用酶-超聲波聯(lián)用技術(shù)提取紫薯色素的研究鮮有報(bào)道。由于紫薯中含有大量的纖維素[13]，采用纖維素酶可以較溫和地將紫薯中的纖維素水解，有效地破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，加速色素成分的釋放，從而提高提取率[14]。超聲波法利用超聲波的空化效應(yīng)、高速?zèng)_擊破碎等作用，破壞提取物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使提取液更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，加速有效成分的溶出[15]。本實(shí)驗(yàn)采用酶-超聲波聯(lián)用技術(shù)提取紫薯色素，并對(duì)其提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)對(duì)超聲波、酶法及酶-超聲波聯(lián)用三種提取方法進(jìn)行比較，旨在為紫薯色素的提取提供一種新工藝及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯 昆明呈貢；纖維素酶 酶活力33IU/mL，江蘇淮安百麥綠色生物能源有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉 國產(chǎn)分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

UV-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；TC-200B型變頻恒溫?fù)u床 上海天呈科技有限公司；SCQ型數(shù)控加熱超聲波清洗器 上海聲彥超聲波儀器有限公司；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；FE20型pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯色素的提取工藝流程 新鮮紫薯洗凈去皮切片，60℃烘干，粉碎過60目篩，得到紫薯粉末，置于密閉容器中備用。準(zhǔn)確稱取1.0g紫薯粉置于100mL具塞三角瓶中，加入一定量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，加適量的纖維素酶，置于恒溫?fù)u床中（100r/min）在一定溫度下提取一定時(shí)間；將三角瓶及內(nèi)容物冷卻至室溫，放入超聲波清洗機(jī)中（超聲頻率40kHz，超聲功率為150W），在一定超聲溫度條件下處理一定時(shí)間；最后，3000r/min離心15min，得到提取液。

1.2.2 紫薯色素最大吸收峰測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1.0g紫薯粉，加入20mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，在50℃水浴鍋中浸提1h，3000r/min離心15min后，取上清液，在200～800nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定吸光度值，篩選最大吸收峰波長。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 在其他相同的提取條件下（酶解時(shí)間45min，酶解溫度50℃，超聲溫度50℃），以紫薯色素在最大吸收峰處的吸光度值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，間接反映紫薯色素的提取率。分別考察纖維素酶用量（5、10、15、20、25IU/g）、酶解時(shí)間（15、30、45、60、75min）、酶解溫度（20、30、40、50、60℃）、酶解pH（3.2、4.0、4.8、5.6、6.6）、料液比（紫薯粉：提取液）（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30g/mL）、超聲溫度（30、40、50、60、70℃）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50min）7個(gè)單因素對(duì)紫薯色素提取率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)中選取對(duì)紫薯色素提取影響較大的四個(gè)因素，按正交表設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）的正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化最佳提取工藝，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The level of orthogonal experimental factors

1.2.5 提取級(jí)數(shù)的確定 按正交實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件對(duì)紫薯色素進(jìn)行反復(fù)提取，至提取液基本呈無色，收集提取液，測(cè)定各次提取液體積V及其在最大吸收峰處的吸光度值A(chǔ)。將各次提取液合并得到總體積VT以及總吸光度值A(chǔ)T，提取率按下式計(jì)算，確定最佳提取次數(shù)。

1.2.6 不同提取方法的比較 在正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的最佳提取工藝條件下，分別采用單獨(dú)的酶法、單獨(dú)的超聲波法和酶-超聲聯(lián)用法提取紫薯色素，分別收集其提取液定容至50mL容量瓶，測(cè)定各溶液在最大吸收峰處的吸光度值。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫薯色素最大吸收峰的確定

紫薯色素的紫外-可見吸收光譜圖見圖1。從圖1中可以看出，在526nm處具有最大吸收峰。這與文獻(xiàn)[12]所報(bào)道的紫薯花色苷色素的特征吸收峰基本吻合。因此，本實(shí)驗(yàn)選取526nm作為紫薯色素的最大吸收峰。

圖1 紫薯色素的紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-Vis absorption spectrogram of purple sweet potato pigment

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 纖維素酶用量對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖2可見，隨著纖維素酶用量的增加，紫薯色素的提取率不斷增大。這是因?yàn)樽鲜碇泻写罅康睦w維素物質(zhì)，它與色素類物質(zhì)結(jié)合緊密，纖維素酶能促進(jìn)纖維素解鏈，使得更多的色素物質(zhì)釋放，從而使得紫薯色素提取率提高。當(dāng)纖維素酶用量超過15IU/g時(shí)，紫薯色素的提取率增加不明顯，這是因?yàn)榇藭r(shí)酶解反應(yīng)基本達(dá)到了飽和。因此，初步推測(cè)較適宜的纖維素酶用量為15IU/g。

圖2 纖維素酶用量對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.2 Effect of cellulase dose on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖3可見，隨著酶解時(shí)間的延長，紫薯色素提取率先增加后略有降低。這可能是因?yàn)槊附鈺r(shí)間的延長，造成了少量紫薯色素分子的破壞。在酶解時(shí)間為45min時(shí)，紫薯色素提取率出現(xiàn)最大值。因此，初步推測(cè)比較合適的酶解時(shí)間為45min。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.2.3 酶解溫度對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖4可見，在一定溫度范圍內(nèi)（30～50℃），隨著溫度的升高，紫薯色素的提取率也隨之增加，這是由于溫度的升高使纖維素酶的活力增強(qiáng)，提高了酶解反應(yīng)的速度，加快了纖維素的降解，使得色素得以釋放。當(dāng)溫度超過50℃時(shí)，紫薯色素提取率顯著降低，這是因?yàn)闇囟冗^高可能導(dǎo)致部分紫薯色素發(fā)生降解，同時(shí)部分酶活力失活，最終導(dǎo)致紫薯色素提取率降低。因此，初步推測(cè)50℃為較適宜的酶解溫度。

圖4 酶解溫度對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.2.4 酶解pH對(duì)紫薯色素提取的影響 從圖5可以看出，隨著酶解pH的增加，紫薯色素的提取率先增加后下降。在pH為4.8時(shí)，紫薯色素的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槔w維素酶的最佳作用pH為3.0～5.0，在此范圍纖維素具有最大的活力，可加速紫薯中纖維素的降解，使得紫薯色素的溶出效率提高。因此，初步推斷4.8為較合適的酶解pH。

2.2.5 料液比對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖6可以看出，隨著料液比的增大，紫薯色素的提取率先增大后降低。這是因?yàn)樵诿附獾倪^程中，隨著溶液量的增加，提取液和紫薯粉末之間的接觸面積增大，有利于纖維素酶對(duì)紫薯細(xì)胞壁纖維素的降解，使得紫薯細(xì)胞迅速破裂，有利于紫薯色素的溶出。但是隨著料液比的不斷增加，提取液中纖維素酶的濃度也隨之減小，酶解反應(yīng)速率降低。因此，綜合經(jīng)濟(jì)成本及后續(xù)濃縮處理等因素的考慮，初步推斷適宜的料液比為1∶15（g/mL）。

圖5 酶解pH對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate of purple sweet potato pigment

圖6 液料比對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.2.6 超聲溫度對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖7可以看出，當(dāng)超聲溫度為60℃時(shí)，紫薯色素的提取率達(dá)到最大值。當(dāng)超聲溫度超過60℃時(shí)，紫薯色素提取率降低，這是因?yàn)樘烊簧貙?duì)熱的穩(wěn)定性不同，當(dāng)提取溫度過高時(shí)，會(huì)破壞色素結(jié)構(gòu)，造成提取率下降。因此，初步推測(cè)超聲溫度為60℃為宜。

圖7 超聲溫度對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic temperature on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.2.7 超聲時(shí)間對(duì)紫薯色素提取的影響 由圖8可以看出，紫薯色素的提取率隨著超聲時(shí)間的延長先增加后減小。當(dāng)超聲時(shí)間為20min時(shí)，紫薯色素的提取率達(dá)到最大值。這是因?yàn)槌晻r(shí)間較短時(shí)，色素不易溶出，超聲時(shí)間過長時(shí)，色素又會(huì)因長時(shí)間受熱而分解。因此，初步推斷超聲20min對(duì)紫薯色素的提取效果最好。

圖8 超聲時(shí)間對(duì)紫薯色素提取率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic time on extraction rate of purple sweet potato pigment

綜上，由圖2～圖8可以看出，纖維素酶用量、酶解pH、料液比和超聲時(shí)間對(duì)紫薯色素的提取率的影響較大，所以選擇這四個(gè)因素作為正交實(shí)驗(yàn)的考察因素，對(duì)酶-超聲聯(lián)用提取紫薯色素的工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.3 酶-超聲波聯(lián)用提取紫薯色素最佳工藝條件的優(yōu)化

選取纖維素酶用量、酶解pH、料液比和超聲時(shí)間作為考察因素，以紫薯色素在526nm處的吸光度值為考察指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見表3。

從表2的極差分析可知，各因素對(duì)紫薯色素提取率的影響順序?yàn)椋毫弦罕龋久附鈖H＞纖維素酶用量＞超聲時(shí)間，以影響最小的因素D作為誤差列，選擇因素A、B、C做進(jìn)一步的方差分析，結(jié)果如表3所示。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of L9（34）orthogonal experiment

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis

從表3方差分析結(jié)果可以看出，料液比對(duì)紫薯色素提取有顯著性影響，其余為不顯著因素。結(jié)合表2極差分析的結(jié)果，可以確定最佳提取組合為A3B3C1D2。按照A3B3C1D2做驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，紫薯色素在526nm處的吸光度值可達(dá)0.847。因此，酶-超聲波聯(lián)用提取紫薯色素的最佳工藝參數(shù)為：纖維素酶用量20IU/g，酶解pH5.6，料液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間20min。

2.4 提取次數(shù)的確定

按正交實(shí)驗(yàn)的最佳提取工藝參數(shù)，對(duì)紫薯色素進(jìn)行多次提取，并計(jì)算提取率，結(jié)果如表4所示。由表4可見，提取3次時(shí)，提取率達(dá)到98.7%，可將絕大部分色素溶出，所以最佳提取次數(shù)確定為3次。

表4 提取次數(shù)對(duì)紫薯色素提取率的影響Table 4 Effect of extraction times on extraction rate of purple sweet potato pigment

2.5 紫薯色素三種不同提取方法的比較

分別用酶解法、超聲法、酶-超聲聯(lián)用法提取紫薯色素，比較三種提取方法對(duì)紫薯色素提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶法、超聲法、酶-超聲波聯(lián)用法提取紫薯色素測(cè)得A526nm分別為0.608、0.704、0.847。酶-超聲波聯(lián)用法的紫薯色素提取率相比酶法和超聲法分別提高了39.3%和20.3%，可見酶-超聲波聯(lián)用提取法可以有效提高紫薯色素的提取率，比單獨(dú)使用酶法、超聲法提取的效果要好。

3 結(jié)論

3.1 通過單因素及正交實(shí)驗(yàn)確定了紫薯色素的最佳提取工藝參數(shù)為：纖維素酶用量20IU/g，酶解時(shí)間45min，酶解溫度50℃，酶解pH 5.6，料液比1∶10（g/mL），超聲時(shí)間20min，超聲溫度50℃。

3.2 在最佳提取工藝參數(shù)條件下提取紫薯色素，提取次數(shù)為3次時(shí)，紫薯色素的提取率可達(dá)98.7%，可將絕大多數(shù)紫薯色素提取溶出。

3.3 與酶法、超聲波提取法相比，酶-超聲波聯(lián)用法提取紫薯色素的提取率分別增加了39.3%和20.3%，使得紫薯色素的提取率大大提高。因此，酶-超聲波聯(lián)用技術(shù)是提取紫薯色素的一種高效提取方法，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

[1]曹雁平.我國天然食用色素研究現(xiàn)狀[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（1）：80-84.

[2]王靜，劉昭明，肖凱軍，等.天然食用色素的結(jié)構(gòu)與生理活性分析[J].食品工業(yè)科技，2007，28（12）：208-212.

[3]Hallagan J B，Allen D C，Borzelleca J F.The safety and regulatory status of food，drug and cosmetics colour additives exempt from certification[J].Food and Chemical Toxicology，1995，33（6）：515-528.

[4]楊巍，黃潔瓊，陳英，等.紫薯的營養(yǎng)價(jià)值與產(chǎn)品開發(fā)[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2011（8）：41-43.

[5]胡夢(mèng)琳，楊甲甲，代濤，等.紫薯色素兩種提取方法的比對(duì)研究[J].食品科學(xué)，2011，32（6）：247-249.

[6]Zhu H M，Zhao M.Study on chemical constituents and antioxidation activity of anthocyanins from Ipomoea batatas L（purple sweet potato）[J].Chemistry and Industry of Forest Products，2009，29（1）：39-45.

[7]Yoshimoto M，Okuno S，Yamaguchi M，et al.Antimutagenicity of deacyleated anthocyanin in purple-fleshed sweet potato[J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2001，65（7）：1652-1656.

[8]Li J W，Zhang L F，Liu Y F.Optimization of extraction of natural pigment from purple sweet potato by response surface methodology and its stability[J].Journal of Chemistry，2013，2013：1-5.

[9]余凡，楊恒拓，葛亞龍，等.紫薯色素的微波提取及其穩(wěn)定性和抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（4）：322-326.

[10]Lu L Z，Zhou Y Z，Zhang Y Q，et al.Anthocyanin extracts from purple sweet potato by means of microwave baking and acidified electrolysed water and their antioxidation in vitro[J]. International Journal of Food Science&Technology，2010，45（7）：1378-1385.

[11]顧紅梅，張新申，蔣小萍.紫薯中花青素的超聲波提取工藝[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16（3）：404-408.

[12]劉潔，葉婷婷.酶-微波輔助提取紫薯花青素的工藝研究[J].廣州化工，2012，40（21）：60-62.

[13]高路，成義.分子篩-微生物發(fā)酵結(jié)合法制備紫薯渣膳食纖維研究（II）[J].糧食與油脂，2012（3）：26-28.

[14]李治華，謝江，黃馳，等.紫甘薯花青素提取純化技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（27）：192-194.

[15]Chen F，Sun Y Z，Zhao G H，et al.Optimization of ultrasound-assisted extraction of anthocyanins in red raspbeeries and identification ofanthocyanins in extractusing high performance liquid chromatography-mass spectrometry[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2007，14（6）：767-778.

Study on enzyme-ultrasonic combined extraction method of purple sweet potato pigment

LI Hui1，2，MENG Ya-hong1，2，F(xiàn)U Yan-qing1，2，SUN Li-ping1，2，PENG Lin-cai2
（1.Yunnan Province Food Safety Research Institute，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China；2.Faculty of Chemical Engineering，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

The enzyme-ultrasonic combined extraction method of purple sweet potato pigment was studied by single factor experiment and L9（34）orthogonal experiment.The results showed that the optimum extraction conditions were obtained as follows：cellulase dose 20IU/g，enzymatic hydrolysis time 45min，enzymatic hydrolysis temperature 50℃，enzymatic hydrolysis pH5.6，solid-liquid ratio 1∶10，ultrasonic time 20min and ultrasonic temperature 60℃.Under the optimum conditions，the extraction rate reached up to 98.7%after three times extractions.Furthermore，the three extraction methods（enzymatic extraction，ultrasonic extraction and enzymeultrasonic combined extraction）were compared.The pigment extraction rate of enzyme-ultrasonic combined extraction method increased by 39.3%and 20.3%respectively compared to that of enzyme extraction and ultrasonic extraction.The results of this study indicated that pigment extraction rate of enzyme-ultrasonic combined extraction method was the highest.This study would provide a new extraction method for purple sweet potato pigment.

purple sweet potato；purple sweet potato pigment；cellulose；ultrasonic

TS255.1

B

1002-0306（2014）14-0256-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.048

2013－11－19

李輝（1985-），女，博士，講師，研究方向：食品化學(xué)。

云南省省級(jí)人培項(xiàng)目（KKSY201305002）。