阿拉伯呋喃糖苷水解酶對(duì)啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能的影響

高 飛，金 昭，蔡國(guó)林，董建軍，陸 健，5，*（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫21122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫21122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫21122；.啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266061；5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶對(duì)啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能的影響

高 飛1，2，3，金 昭1，2，3，蔡國(guó)林1，3，董建軍4，陸 健1，2，3，5，*
（1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；4.啤酒生物發(fā)酵工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島266061；5.宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇宿遷223800）

阿拉伯呋喃糖苷水解酶（Arabinoxylan arabinofuranohydrolase，AXAH）是阿拉伯木聚糖完全降解的關(guān)鍵酶之一。本文比較了過(guò)濾性能差異顯著的江蘇單二和港啤大麥麥芽與進(jìn)口Metcalfe和Baudin大麥麥芽中的AXAH活力，發(fā)現(xiàn)單二和港啤中的AXAH平均活力只是Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。為了進(jìn)一步確定AXAH對(duì)大麥麥芽過(guò)濾性能的影響，文章通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀、SP FF和Q FF離子柱層析以及Sephacryl S-100 HR凝膠過(guò)濾層析技術(shù)對(duì)單二大麥麥芽中AXAH進(jìn)行了純化，并將其添加到協(xié)定糖化過(guò)程的起始階段。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加酶量達(dá)到6mU/g時(shí)，協(xié)定糖化麥汁的過(guò)濾速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麥汁濁度增加了32.5%。這一結(jié)果表明，添加AXAH及其與其他水解酶協(xié)同作用，促進(jìn)了多聚阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖以及高分子氮的降低，也促進(jìn)了阿拉伯木聚糖和麥汁總氮含量的升高。

大麥麥芽，過(guò)濾性能，阿拉伯呋喃糖苷水解酶，協(xié)定糖化

大麥麥芽是啤酒釀造的主要原料之一，其品質(zhì)的優(yōu)劣直接影響著啤酒釀造的整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程。過(guò)濾性能是評(píng)價(jià)大麥麥芽質(zhì)量的重要參數(shù)之一，主要包括過(guò)濾速度、粘度及濁度三個(gè)方面。江蘇是中國(guó)主要的啤酒大麥產(chǎn)區(qū)之一，然而部分江蘇啤酒大麥麥芽質(zhì)量相對(duì)于進(jìn)口的品質(zhì)優(yōu)良啤酒大麥（如加拿大Metcalfe品種）制得的麥芽有著明顯的差距，過(guò)濾性能缺陷就是其中之一，如因麥芽制得麥汁的過(guò)濾速度緩慢而延長(zhǎng)了麥汁的生產(chǎn)時(shí)間，麥汁濁度高而易引起啤酒的非生物渾濁等質(zhì)量問(wèn)題[1-2]，這已嚴(yán)重影響了部分江蘇大麥麥芽在中國(guó)啤酒行業(yè)中的應(yīng)用。

麥芽中大分子物質(zhì)的不完全降解，是造成麥汁過(guò)濾速度慢的直接原因，這些大分子物質(zhì)主要包括阿拉伯木聚糖（Arabinoxylan，AX）、β-葡聚糖和蛋白[3-4]。近年來(lái)，阿拉伯木聚糖、多聚阿拉伯木聚糖（PAX）對(duì)過(guò)濾性能的影響得到了越來(lái)越多的關(guān)注[5-7]。阿拉伯木聚糖降解酶之一的阿拉伯呋喃糖苷酶，可通過(guò)降解阿拉伯呋喃糖單元來(lái)加速木聚糖內(nèi)切酶等的催化水解作用。而屬于阿拉伯呋喃糖苷酶GH51家族的AXAH，具有其他阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。AXAH通過(guò)催化水解去除阿拉伯木聚糖上的阿拉伯呋喃糖苷殘基，改變空間構(gòu)型，促進(jìn)酶-底物復(fù)合物的形成，并與木聚糖內(nèi)切酶等協(xié)同作用，可顯著加快阿拉伯木聚糖的降解速度。金昭[9]采用基于熒光差異雙向電泳的比較蛋白質(zhì)組學(xué)策略，比較了江蘇單二大麥麥芽與加拿大Metcalfe大麥麥芽的代謝蛋白質(zhì)組，蛋白質(zhì)的差異包括Metcalfe中兩個(gè)豐度比單二高的AXAH-I斑點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)AXAH的研究較少，其對(duì)過(guò)濾性能影響的研究至今沒(méi)有報(bào)道。

本文在金昭通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究麥芽過(guò)濾性能影響因素的基礎(chǔ)上，比較了過(guò)濾性能差異顯著的江蘇單二和港啤大麥麥芽與進(jìn)口Metcalfe和Baudin大麥麥芽中的AXAH活力，并考察了其對(duì)過(guò)濾性能的影響，希望為進(jìn)一步闡明影響江蘇啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能缺陷的因素提供參考，也為從基因水平修復(fù)江蘇啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能的缺陷提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

商品麥芽 大麥品種為Metcalfe大麥（2012年，加拿大），Baudin大麥（2012年，澳大利亞），單二及港啤大麥（2012年，中國(guó)江蘇）四種大麥麥芽均由國(guó)內(nèi)同一麥芽生產(chǎn)公司提供；溴酚藍(lán)、TEMED等 均為GE公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉、過(guò)硫酸銨、考馬斯亮藍(lán)G-250、考馬斯亮藍(lán)R-250等 均為上海生工進(jìn)口分裝產(chǎn)品；4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷 為西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；對(duì)硝基酚、無(wú)水乙醇、甘油、正丁醇、冰醋酸、磷酸、三氯乙酸、丙酮、三羥氨基甲烷、醋酸鈉、醋酸、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉等 均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

MALDI-TOF-TOF型串聯(lián)質(zhì)譜 美國(guó)布魯克-道爾頓公司；AKTA avant 25型蛋白純化系統(tǒng)、HiPrep 16/10 Q FF及HiTrap 16/10 SP-FF型層析柱、HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR等 均為GE公司產(chǎn)品；Pico＆Fresco 17型微量高速冷凍離心機(jī)、Haake型落球式粘度計(jì) Thermo公司；UV-2100型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；Spectra Max Plus 384型酶標(biāo)儀、Molecular Devices、JD-801型凝膠電泳圖像分析系統(tǒng) 江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司；自動(dòng)糖化器 輕工部西安輕機(jī)所光電公司；麥芽標(biāo)準(zhǔn)粉碎機(jī) 北京德之杰啤酒技術(shù)有限責(zé)任公司；WGZ-2-PJ型濁度計(jì) 上海昕瑞儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 麥芽常規(guī)指標(biāo)的測(cè)定 具體方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 麥芽中AXAH的酶活測(cè)定 取一定量的麥芽樣品研磨為細(xì)粉，與pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液按1∶4混合，室溫振蕩30min，10000r/min離心10min，取上清液即得酶液樣品。

采用Ferre H等[11]建立的檢測(cè)阿拉伯呋喃糖苷水解酶酶活的方法測(cè)定。取0.5mL底物（0.5mmol/L）與適當(dāng)稀釋的酶液，40℃條件下反應(yīng)30min，立即加入1mL 0.5mol/L的Na2CO3終止反應(yīng)。于410nm波長(zhǎng)處比色，以底物、鈍化酶等反應(yīng)體系為空白。

酶活定義：每分鐘反應(yīng)水解1滋mol對(duì)硝基苯酚所需的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.3 AXAH-I的分離純化[8，11]取單二大麥麥芽細(xì)粉，與pH5.0、0.1mol/L的醋酸-醋酸鹽緩沖液以1∶4混合，4℃浸提過(guò)夜。將浸提液8000r/min離心15min，取上清液加入硫酸銨至飽和度20%去除部分雜蛋白，再在上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至飽和度40%，沉淀復(fù)溶并用pH5.0、50mmol/L的醋酸-醋酸鹽緩沖液于4℃透析過(guò)夜，所得即為粗酶液。將透析后酶液上樣于HiTrap 16/10 SP FF陽(yáng)離子交換柱（設(shè)定洗脫流速為4mL/min，每管收集4mL）并檢測(cè)收集管的酶活力，收集有酶活的組分濃縮、調(diào)整pH5.2后上樣于HiPrep 16/10 Q FF陰離子交換柱（設(shè)定洗脫流速為4mL/min，每管收集4mL），收集有酶活的組分進(jìn)行濃縮處理后上樣于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝膠柱（設(shè)定洗脫流速為0.5mL/min，每管收集1mL）檢測(cè)每管洗脫液的酶活力，收集具有酶活的組分進(jìn)行冷凍干燥備用。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法[12]，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.5 AXAH-I的鑒定 采用SDS-PAGE（其分離膠質(zhì)量濃度為12.5g/100mL，濃縮膠質(zhì)量濃度為5g/100mL）、串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）分析和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBInr）檢索（http：//www.matrixscience.com/）[13]進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

1.2.6 AXAH-I的添加實(shí)驗(yàn) 在單二麥芽糖化的起始階段添加純化的AXAH-I，添加的酶量為單二和港啤麥芽與Metcalfe和Baudin麥芽平均AXAH-I活力差距（4mU/g）的0.5～1.5倍，即0、2、4和6mU/g。糖化結(jié)束后，測(cè)定麥芽的過(guò)濾性能及相關(guān)指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同品種大麥麥芽過(guò)濾性能的比較

通過(guò)協(xié)定糖化法，四種麥芽制得麥汁的相關(guān)指標(biāo)如表1所示。從表1可得Metcalfe、Baudin大麥麥芽的品質(zhì)明顯優(yōu)于單二、港啤大麥麥芽品質(zhì)，與過(guò)濾性能相關(guān)的各項(xiàng)指標(biāo)也具有明顯優(yōu)勢(shì)：進(jìn)口Metcalfe和Baudin麥芽協(xié)定麥汁的在過(guò)濾速度顯著高于單二和港啤麥芽；而單二和港啤麥芽的濁度、粘度、阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖含量高于Metcalfe和Baudin麥芽。

麥芽中的大分子物質(zhì)（主要為β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖、蛋白質(zhì)和多酚）被普遍認(rèn)為是引起麥汁過(guò)濾性能差的主要物質(zhì)。金昭發(fā)現(xiàn)這些大分子物質(zhì)在單二和Metcalfe麥芽的協(xié)定麥汁之間含量差別較大，而在這兩個(gè)品種的大麥之間的差別很小[9]。可推斷，催化大分子物質(zhì)代謝相關(guān)的酶在單二、港啤和Metcalfe、Baudin麥芽之間存在著差異。而目前市場(chǎng)上針對(duì)于麥芽過(guò)濾性能缺陷開(kāi)發(fā)出了多種酶制劑，β-葡聚糖內(nèi)切酶、阿拉伯木聚糖內(nèi)切酶、蛋白酶是主要成分，但是江蘇啤酒大麥麥芽的過(guò)濾性能仍然沒(méi)有明顯的改觀。因此，需要考察參與這些大分子物質(zhì)代謝的其他酶類。

2.2 麥芽中AXAH活力的測(cè)定

大麥中AXAH有兩個(gè)同功酶AXAH-I和-II，AXAH-I已被證明存在，而AXAH-II是根據(jù)基因序列推測(cè)出來(lái)的，目前仍未被證實(shí)[8]。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了2012年的江蘇單二、港啤大麥麥芽和Metcalfe、Baudin大麥麥芽中AXAH活力（如圖1所示）。發(fā)現(xiàn)江蘇單二和港啤麥芽中的AXAH平均活力比Metcalfe和Baudin中平均活力低了4mU/g，只相當(dāng)于Metcalfe和Baudin中平均活力的60%。

圖1 不同品種麥芽的AXAH活力Fig.1 Activities of AXAH in different types of malts

阿拉伯木聚糖的完全降解需要一系列木聚糖降解酶，主要包括木聚糖內(nèi)切酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶和阿魏酸酯酶[14]。AXAH能從谷物細(xì)胞壁阿拉伯木聚糖上釋放L-阿拉伯糖，主要作用于阿拉伯木聚糖主鏈上C（O）3鏈接的α-L-阿拉伯呋喃糖苷單取代基和雙取代基，且其能與其他酶協(xié)同作用快速降解阿拉伯木聚糖，而大麥AXAH更具有其他α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶所不具有的水解阿拉伯木聚糖的能力[8]。因此，單二大麥麥芽中較低的AXAH活力是導(dǎo)致其過(guò)濾性能差的一個(gè)不利因素。

2.3 AXAH-I的分離純化

圖2 HiTrap SP FF柱層析洗脫圖譜Fig.2 Cation exchange SP FF chromatography

圖3 HiTrap Q FF柱層析洗脫圖譜Fig.3 Anion exchange Q FF chromatography

表1 不同品種麥芽常規(guī)指標(biāo)及過(guò)濾性能的比較Table 1 Comparison of malt quality parameters and filterability between Daner and Metcalfe malt

粗提取樣品進(jìn)行20%～40%飽和度的硫酸銨沉淀后所得的粗酶液先上樣于HiTrap SP FF柱，將穿透峰中有酶活部分（如圖2所示）收集混合（結(jié)合Ferre H等[11]的研究不收集洗脫峰中酶活部分），調(diào)整pH為5.2后，再上樣于HiPrep 16/10 Q FF柱，收集洗脫峰中有酶活部分（如圖3所示）。將收集樣品處理后，再上樣于HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，收集最終純化得到的AXAH酶樣品（如圖4所示）。

圖4 Sephacryl S-100 HR凝膠柱層析洗脫圖譜Fig.4 Sephacryl S-100 HR chromatography

分離純化的SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，泳道5的兩個(gè)條帶經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析結(jié)果顯示都為arabinoxylan arabinofuranohydrolase isoenzyme AXAH-I[Hordeum vulgare]（登錄號(hào)為gi13398412），且Mr為72557，pI為5.05。這一結(jié)果與金昭[9]的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果相符，也與Robert C L等[8]和Ferre H等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，60ku左右的條帶為蛋白質(zhì)翻譯后修飾體。

圖5 AXAH-I純化各階段SDS-PAGE電泳圖譜Fig.5 SDS-PAGE of protein fractions during the purification of AXAH-I

2.4 AXAH-I對(duì)江蘇單二啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能的影響

在單二麥芽的協(xié)定糖化過(guò)程中添加純化的AXAH-I，隨著AXAH-I添加量的增加，麥芽的過(guò)濾性能變化及相關(guān)物質(zhì)指標(biāo)如表2所示。

由表2可見(jiàn)，隨著AXAH-I添加量的增加，麥汁的過(guò)濾速度和浸出率逐步升高，粘度降低，濁度升高。當(dāng)酶添加量為6mU/g時(shí)，過(guò)濾速度提高了34.2%，粘度降低了5.5%，麥汁濁度增加了32.5%。阿拉伯木聚糖和總氮含量隨著酶添加量的增加而增加，這說(shuō)明添加AXAH-I到糖化過(guò)程中，促進(jìn)了阿拉伯木聚糖和蛋白質(zhì)的溶解，而在AXAH-I及其與其他水解酶的協(xié)同作用下，PAX和高分子氮的含量不斷減小。總體而言，β-葡聚糖含量隨著AXAH-I添加量的增加而降低。據(jù)Kanauchi M等報(bào)道，阿拉伯呋喃糖苷酶可促進(jìn)β-葡聚糖的溶解[15]。但由于剛果紅法只檢測(cè)高分子量的β-葡聚糖，所以本研究里沒(méi)有充分反映添加AXAH-I對(duì)β-葡聚糖溶解的影響。

PAX、β-葡聚糖及高分子蛋白質(zhì)的不充分降解，就會(huì)引起麥汁粘度高，麥汁過(guò)濾困難和導(dǎo)致渾濁等問(wèn)題。同時(shí)，它們的降解程度，限制著其他酶進(jìn)入胚乳細(xì)胞壁，進(jìn)而影響到胚乳的溶解。胚乳細(xì)胞以淀粉顆粒為核心，外層主要包裹著β-葡聚糖、阿拉伯木聚糖和少量的纖維素，細(xì)胞之間有蛋白質(zhì)交聯(lián)[16]，蛋白質(zhì)易與多酚結(jié)合形成可溶性復(fù)合物，這些可溶性復(fù)合物變成膠體顆粒，并隨之逐漸變大，從而引起麥汁渾濁等[17]。研究結(jié)果可證明，在過(guò)濾性能顯著差異的單二、港啤和Metcalfe、Baudin麥芽之間AXAH活力差異較大，且分離純化的AXAH-I通過(guò)改善大分子物質(zhì)的溶解和促進(jìn)它們的降解而對(duì)麥芽的過(guò)濾性能有著重要的影響。

表2 AXAH-I對(duì)單二麥芽過(guò)濾性能的影響Table 2 Effect of AXAH on the filterability of Dan’er malt

3 結(jié)論

在采用比較蛋白質(zhì)組學(xué)手段研究發(fā)現(xiàn)江蘇單二大麥麥芽AXAH-I的表達(dá)豐度比加拿大Metcalfe大麥麥芽中較低的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步比較了四種麥芽中AXAH的活力，發(fā)現(xiàn)單二、港啤大麥麥芽中AXAH的平均活力只相當(dāng)于Metcalfe和Baudin中的60%。從單二大麥麥芽中分離純化得到AXAH-I，并將其添加到單二麥芽糖化過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)加入AXAH-I后，在其自身作用及其與其他水解酶的協(xié)同作用下，促進(jìn)了蛋白質(zhì)和阿拉伯木聚糖的溶解，以及高分子蛋白質(zhì)、PAX和β-葡聚糖的降解。并且，隨著AXAH-I添加量的增加，麥芽的過(guò)濾速度和粘度得到逐漸的改善。而麥汁濁度的升高主要是由于單二大麥麥芽在其他代謝蛋白質(zhì)方面也存在缺陷問(wèn)題，比如β-淀粉酶的不足。總體而言，糖化過(guò)程中彌補(bǔ)所缺失的AXAH-I有利于大分子物質(zhì)的溶解和降解，促進(jìn)其麥芽品質(zhì)的改善。其可應(yīng)用于改善江蘇啤酒大麥麥芽過(guò)濾性能的研究。

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Effect of arabinoxylan arabinofuranohydrolases of Jiangsu barley malt on the filterability

GAO Fei1，2，3，JIN Zhao1，2，3，CAI Guo-lin1，3，DONG Jian-jun4，LU Jian1，2，3，5，*
（1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；4.State Key Laboratory of Biological Fermentation Engineering of Beer，Qingdao 266061，China；5.Industrial Technology Research Institute of Jiangnan University in Suqian，888 Renmin Road，Suqian 223800，China）

Arabinoxylan arabinofuranohydrolase（AXAH）is one of the key degrading enzymes of arabinoxylan.The activitiesofAXAHbetweenJiangsubarleymalt（Dan’erandGangpi）andimportedbarleymalt（MetcalfeandBaudin）with different filterability were compared，the results found that AXAH average activities in Dan’er and Gangpi was only about 60%of that in Metcalfe and Baudin.In order to confirm effect of AXAH on the malt filterability，AXAH was isolated from Dan’er barley malt by ammonium sulfate precipitation，SP FF and Q FF ion exchange chromatography and Sephacryl S-100 HR gel filtration chromatography，and was then added into mash during the initial period of congress mash.The filtration rate of wort increased 34.2%when 6mU/g of AXAH was added，the viscosity decreased 5.5%but the turbidity increased 32.5%.These results showed that the added AXAH and its synergistic effect with others hydrolases promote the decrease of contents of polymeric arabinoxylans（PAX），β-glucan and macromolecular nitrogen，but the increase of contents of AX and total nitrogen of wort.

barley malt；filterability；arabinoxylan arabinofuranohydrolase；congress mash

TS261.2

A

1002-0306（2014）14-0237-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.044

2013－09－27 *通訊聯(lián)系人

高飛（1988-），男，碩士研究生，研究方向：釀酒科學(xué)與工程。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171736）；國(guó)家863計(jì)劃（2013AA102109）；江蘇省普通高等學(xué)?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項(xiàng)目（JHB2012-26）；江蘇省科技支撐計(jì)劃（BE2012397）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（JUDCF10047）；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。