杏鮑菇產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件優(yōu)化及其對菲的降解特性研究

葛 飛，張慧敏，龔 倩，朱龍寶，李婉珍，桂 琳（.安徽工程大學微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖4000；.皖南醫(yī)學院微生物與免疫學教研室，安徽蕪湖4000）

杏鮑菇產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件優(yōu)化及其對菲的降解特性研究

葛 飛1，張慧敏1，龔 倩1，朱龍寶1，李婉珍1，桂 琳2
（1.安徽工程大學微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學院微生物與免疫學教研室，安徽蕪湖241000）

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken實驗設計方法，以漆酶酶活為響應值，對杏鮑菇發(fā)酵產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，并經(jīng)實驗驗證模型的可行性。最終得到優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件為：轉(zhuǎn)速131r/min，裝液量32mL，溫度27.6℃；在此條件下杏鮑菇對菲具有較高的降解率，培養(yǎng)12d后，菲降解率達82.86%。

杏鮑菇，漆酶，培養(yǎng)條件，響應面法，菲

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）屬真菌門，擔子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，又名刺芹側(cè)耳[1]。漆酶（EC1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，該酶在白腐真菌中普遍存在，多為分泌型糖蛋白[2]。漆酶首次是從日本漆樹的汁液中分離而得到的，所以得名漆酶[3]。有關漆酶的研究報道已有一百多年的歷史[4]，由于漆酶具有廣泛的底物專一性和較好的穩(wěn)定性，可以轉(zhuǎn)化多環(huán)芳香化合物類、氯代酚類、多氯聯(lián)苯類、二氯苯胺類等多種難降解的有機化合物[2]，所以它在食品工業(yè)、廢水處理、生物漂白、芳香化合物轉(zhuǎn)化、環(huán)境監(jiān)測等方面都具有重要的應用價值[5]。

菲（Phe）是多環(huán)芳香化合物中的一種，由3個苯環(huán)構(gòu)成，在環(huán)境中廣泛分布，具有致癌、致畸、致突變的化學結(jié)構(gòu)域，可誘發(fā)魚類和其他生物的癌變、畸變和突變[6]。菲本身并沒有明顯的致癌性，但是其衍生物大都具有弱或中等強度的致癌性；同時，菲因兼具K區(qū)和灣區(qū)結(jié)構(gòu)，因此是致癌多環(huán)芳烴的最小結(jié)構(gòu)單元[7]，所以常作為微生物降解多環(huán)芳烴的研究模型。

響應面法（RSM）是一種最優(yōu)化方法[8]，被廣泛應用于實驗最優(yōu)化條件的尋找。范文霞等[9]將響應面法應用于毛云芝菌產(chǎn)漆酶培養(yǎng)條件的優(yōu)化；Balan Kannan等[10]應用響應面法優(yōu)化影響佛羅里達側(cè)耳染料脫色過程的主要參數(shù)；并分別經(jīng)實驗驗證了模型的可行性。

目前國內(nèi)有關杏鮑菇降解多環(huán)芳烴方面的研究較少，因此，本研究選擇高產(chǎn)漆酶杏鮑菇菌株，采用響應面法對該菌株產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，在優(yōu)化產(chǎn)酶條件下研究該菌株對多環(huán)芳烴菲的降解特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杏鮑菇菌株 由安徽工程大學生物與化學工程學院310實驗室保藏；菲 阿拉丁試劑；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純；土豆 購于蕪湖市場；固體培養(yǎng)基土豆20%，葡萄糖2%，瓊脂1.5%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，自然pH；液體培養(yǎng)基 土豆20%，葡萄糖2%，酵母膏0.5%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，VB10.001%，自然pH。

QHZ-123B型組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱 江蘇省太倉市華美生化儀器廠；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；L5型紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；L550型臺式低速離心機、TG16-W微量高速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FA2204B電子天平 上海佑科。

1.2 菌種擴大培養(yǎng)

將杏鮑菇從斜面接種于固體培養(yǎng)基的平板上，28℃條件下靜置培養(yǎng)10d，至菌絲布滿平板。

1.3 液體培養(yǎng)方法

用無菌打孔器從菌絲平板上取直徑10mm菌片，每個三角瓶接兩片。將接種后的三角瓶置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱進行液體培養(yǎng)。

1.4 漆酶活力測定方法[11]——愈創(chuàng)木酚法

酶活單位定義：1min內(nèi)催化氧化1nmol愈創(chuàng)木酚的酶量為1個酶活單位（U）。愈創(chuàng)木酚基礎反應液配制方法：準確稱取4.5g丁二酸，適量蒸餾水溶解，用0.1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至4.5，取137.4μL愈創(chuàng)木酚，少量95%乙醇溶解，蒸餾水定容至1000mL。3mL反應體系包含2.4mL愈創(chuàng)木酚基礎反應液、0.6mL酶液，30℃水浴中反應30min，于465nm處測定吸光度，以愈創(chuàng)木酚基礎反應液為對照。酶活（U/mL）=13.8×吸光度（30min時）。

粗酶液的制備：取1mL發(fā)酵液，經(jīng)9000r/min離心5min，上清液即為粗酶液。

1.5 單因素實驗

1.5.1 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 在1.1中液體基礎培養(yǎng)配方、自然pH、培養(yǎng)溫度25℃、搖瓶裝液量30mL/100mL條件下，培養(yǎng)20d，其間對漆酶活性峰值進行監(jiān)測，考察不同搖床轉(zhuǎn)速80、110、140、170、200r/min對發(fā)酵液中漆酶合成的影響。

1.5.2 搖瓶裝液量的優(yōu)化 在1.1中液體基礎培養(yǎng)配方、自然pH、培養(yǎng)溫度25℃、140r/min條件下，培養(yǎng)20d，其間對漆酶活性峰值進行監(jiān)測，考察100mL三角瓶裝液量為20、30、40、50、60mL時對發(fā)酵液中漆酶合成的影響。

1.5.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 在1.1中液體基礎培養(yǎng)配方、自然pH、搖床轉(zhuǎn)速140r/min、搖瓶裝液量30mL/ 100mL條件下，培養(yǎng)20d，其間對漆酶活性峰值進行監(jiān)測，考察不同培養(yǎng)溫度24、28、32、36℃對發(fā)酵液中漆酶合成的影響。

1.6 響應面優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素實驗確定的影響杏鮑菇漆酶活性的主要因素進行Box-Behnken設計。實驗設計為三因素三水平，響應值Y為杏鮑菇漆酶活性（U/mL），并用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。因素水平見表1。

1.7 培養(yǎng)基中菲的添加方法

準確稱取一定量菲溶于甲醇，配成10mg/mL的菲濃縮液。100mL空三角瓶滅菌烘干，于無菌操作臺加入0.32mL菲濃縮液，待甲醇完全揮發(fā)，加入32mL滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中菲濃度為100mg/L。

1.8 培養(yǎng)液中殘留菲測定方法

每次都是整瓶萃取，12d結(jié)束培養(yǎng)，量取等體積的環(huán)己烷加入培養(yǎng)液（包含杏鮑菇菌絲體）中，充分振蕩后，超聲波萃取30min，待液體分層。用移液槍移取一定量上清液，經(jīng)適當稀釋在252nm處，測定其吸光值，對照菲標準曲線（y=0.327x，相關系數(shù)R2=0.9995，y為吸光值，x為濃度），得出菲的濃度。降解率D（%）=（Cck-Cf）/Cck×100，殘留率R（%）=Cf/Cck×100，降解速率S（%）=D（%）/d，其中，Cf為培養(yǎng)液中殘留菲的濃度，Cck為空白對照菲的濃度，d為培養(yǎng)天數(shù)。超聲波提取法是美國EPA推薦的多環(huán)芳烴提取方法之一，具有操作簡單、省時、溶劑用量相對較少、萃取效率高等特點，同時超聲波提取還可以打碎細胞，提取出菌體內(nèi)吸附的多環(huán)芳烴[12]。

1.9 生物量的測定

采用菌體干重法，培養(yǎng)液經(jīng)4000r/min離心15min，菌絲體于106℃烘干3h至恒重，測干重（a），扣除瓊脂片重量（b），即為菌體干重（c），即c=a-b。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗優(yōu)化培養(yǎng)條件

2.1.1 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化 由圖1可知，隨著轉(zhuǎn)速的增大，漆酶活性先增后減。搖床轉(zhuǎn)速為140r/min時，漆酶活性最大，搖床轉(zhuǎn)速為200r/min時，漆酶活性最低。分析原因可能是隨著轉(zhuǎn)速的增加，水的剪切力增大，影響到了菌體的產(chǎn)酶；而轉(zhuǎn)速過低時，由于培養(yǎng)液溶氧量減少，也會影響到菌體的產(chǎn)酶。

圖1 不同轉(zhuǎn)速條件下漆酶活性Fig.1 Laccase activity under different speed

2.1.2 搖瓶裝液量的優(yōu)化 由圖2可知，隨著裝液量的增加，漆酶活性也表現(xiàn)為先增后減的趨勢，當裝液量為30mL時，漆酶活性最高。分析原因可能是100mL容積的三角瓶裝液量小于30mL時，菌體所利用的營養(yǎng)物質(zhì)較少，漆酶活性不高；當裝液量超過40mL時，振蕩培養(yǎng)過程中的氧氣不能滿足菌株的生長所需，菌株的生長受到抑制，進而影響到漆酶活性。

圖2 不同裝液量條件下漆酶活性Fig.2 Laccase activity under different liquid volume

2.1.3 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 由圖3可知，隨著溫度的升高，菌株漆酶活性呈現(xiàn)出先增后減的趨勢，溫度為28℃時，漆酶活性最高。溫度過高或過低都會影響菌株產(chǎn)酶，而高溫對菌株的影響特別嚴重，當溫度為36℃時，菌株完全不能生長，經(jīng)測定無漆酶活性。分析原因可能是菌體的生長代謝依靠各種酶類，而它們都有適當?shù)臏囟确秶?/p>

圖3 不同溫度條件下漆酶活性Fig.3 Laccase activity under different temperature

2.2 Box-Behnken響應面實驗結(jié)果與分析

Box-Behnken響應面實驗設計及結(jié)果見表2。

以Y（漆酶活性）為響應值，用Design-Expert軟件對表2中的實驗結(jié)果進行分析，得到三元二次回歸方程：Y=50.51-1.59A+1.63B-2.33C+1.20AB+1.50AC+ 0.13BC-4.58A2-4.10B2-14.42C2。實驗結(jié)果的方差分析見表3。

由表3的結(jié)果分析可知，該模型極顯著（p=0.0001），在模型各參數(shù)中，A、B、C、A2、B2、C2系數(shù)的置信度均在95%水平以上，說明它們在本實驗中均是顯著項，即轉(zhuǎn)速（A）、裝液量（B）和溫度（C）都是對實驗結(jié)果影響較大的因子。該模型相關系數(shù)R2=99.12%、調(diào)整相關系數(shù)R2=97.52%、預測相關系數(shù)R2=95.08%，表明該模型的預測值與實驗值擬合良好，并能做出相對準確的預測。變異系數(shù)CV=3.47%，表明實驗數(shù)據(jù)可靠，分析結(jié)果真實可信。

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken

表3 Box-Behnken Design響應面實驗方差分析表Table 3 Variance analysis table of Box-Behnken

2.3 最適培養(yǎng)條件的確定

運用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析，得到轉(zhuǎn)速（A）、裝液量（B）和溫度（C）三個因素兩兩之間響應面立體分析圖（見圖4～圖6）。曲面圖可以直觀地反映出各因素及其交互作用對響應值的影響，曲面的傾斜度越高，說明兩者交互作用越顯著，另外隨著變化趨勢的劇烈增加，顏色也呈現(xiàn)加深的趨勢。等高線可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。

由響應面方差分析和漆酶活性響應曲面圖可以看出，轉(zhuǎn)速（A）和溫度（C）形成的交互作用比較明顯，接近顯著；轉(zhuǎn)速（A）和裝液量（B）、裝液量（B）和溫度（C）形成的交互作用不顯著。從響應曲面的最高點可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值，既是響應曲面的最高點，同時也是等值線最小橢圓的中心點。轉(zhuǎn)速（A）、裝液量（B）和溫度（C）三個因素在一定的條件下，形成最佳組合，使漆酶活性達到極值。

圖4 轉(zhuǎn)速（A）和裝液量（B）交互影響漆酶活性的響應曲面圖Fig.4 RSD figures of speed（A）and liquid volume（B）interacting on laccase activity

圖5 轉(zhuǎn)速（A）和溫度（C）交互影響漆酶活性的響應曲面圖Fig.5 RSD figures of speed（A）and temperature（C）interacting on Laccase activity

圖6 裝液量（B）溫度（C）交互影響漆酶活性的響應曲面圖Fig.6 RSD figures of liquid volume（B）and temperature（C）interacting on Laccase activity

對響應面分析得到的回歸方程的各個自變量分別進行一階偏導，得到一個三元一次方程組，求解得A=-0.3132，B=0.2776，C=-0.1874，即三個因素的最佳組合為轉(zhuǎn)速131r/min，裝液量32mL，溫度27.6℃，在此條件下預測得到漆酶活性最大值為53.15U/mL。

為了驗證模型的可行性，采用響應面分析所得最優(yōu)條件進行實驗，分別設三個平行，經(jīng)實驗得到實際酶活平均值為52.42U/mL，與預測值相比，相對誤差在2%以內(nèi)，證明該模型擬合較好。因此，采用響應面分析法優(yōu)化得到的杏鮑菇的培養(yǎng)條件準確可靠，具有實際運用價值。

2.4 杏鮑菇對菲的降解特性

響應面優(yōu)化的最佳產(chǎn)酶條件下，研究了該菌株對菲的降解特性。結(jié)果如下：

2.4.1 菌株菲降解曲線和生物量變化研究 由圖7可知，菌株生長的第1～5d，培養(yǎng)液中菲的殘留率較高，均在70%以上，且變化幅度較??；從第7d開始，菲的殘留率明顯降低，并且很快趨于平穩(wěn)。從第11～19d菲的殘留率變化幅度很小，分析原因可能是因為培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，菌體衰亡所致。同時，從生物量變化圖上可以看出，第13d生物量達到最大，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的耗盡，菌體生物量逐漸下降，菲殘留率趨于穩(wěn)定。

圖7 不同培養(yǎng)時間菲殘留率與生物量變化Fig.7 Phenanthrene residue rate and biomass variation in different incubation time

2.4.2 菌株漆酶活力與菲降解相關性研究 由圖8可知，培養(yǎng)的前13d，杏鮑菇漆酶的活力與菲降解率之間有明顯的正相關性。菲降解速率最大的時間段也是漆酶活力增加值最多的時間段。培養(yǎng)后期由于培養(yǎng)基營養(yǎng)的消耗，菌體的衰亡，漆酶活力顯著下降，菲降解速率也隨之明顯下降，表現(xiàn)為降解曲線趨于平穩(wěn)。

圖8 漆酶活性與菲降解率曲線Fig.8 Curve of laccase activity and phenanthrene degradation rate

2.4.3 菲對菌株產(chǎn)漆酶的影響 由圖9可知，在菌株生長的1～5d，有菲培養(yǎng)條件下漆酶活性較無菲培養(yǎng)條件下低，分析原因可能是菲對菌體具有一定的毒性，會對菌體產(chǎn)生抑制作用，但是隨著菌體的生長，其對菲的毒性逐漸適應，并且對其開始分解利用。在有菲培養(yǎng)中酶活峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第11d，而在無菲培養(yǎng)中酶活峰值出現(xiàn)在培養(yǎng)的第13d，有菲條件下明顯高于無菲條件下，峰值分別為53.204U/mL和49.402U/mL，并且在有菲條件下酶活峰值維持時間較長，分析原因可能是菲的毒性在另一方面又成為漆酶活性的刺激物，使其分泌量增加。

圖9 菲對菌株產(chǎn)酶影響比較Fig.9 Comparison of laccase production effect of phenanthrene

2.4.4 不同初始pH條件下菌株對菲的降解情況 初始pH對菲的降解率影響很大，pH為4.0時，菌株完全不能生長，菲降解率為0。pH在5.5～6.5范圍內(nèi)，菌株生長情況良好，菲的降解率接近。超過6.5時，降解率有下降的趨勢。

圖10 不同初始pH條件下菲降解率比較Fig.10 Comparison of phenanthrene degradation rate under different initial conditions of pH

2.4.5 菌株對不同濃度菲的降解特性 由圖11可知，高濃度的菲對菌株的生長沒有抑制作用，菲濃度在0～800mg/L范圍內(nèi)，隨著菲濃度的增大，菲的降解率明顯下降；對生物量的測定結(jié)果表明：菲濃度在0～800mg/L范圍內(nèi)，菌株的生長狀況良好，其最大生物量接近，都在12.50g/L左右。

3 結(jié)論

為了提高杏鮑菇漆酶的活性，本實驗首先通過單因素實驗確定了發(fā)酵培養(yǎng)基的搖床轉(zhuǎn)速、裝液量以及溫度，在此基礎上采用Box-Behnken設計，進行三因素三水平實驗。通過Design-Expert軟件進行分析，得到優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件為：轉(zhuǎn)速131r/min，裝液量32%，溫度27.6℃。在此優(yōu)化產(chǎn)酶條件下研究了該菌株對多環(huán)芳烴菲的降解特性，結(jié)果表明：杏鮑菇在pH5.5～6.5范圍內(nèi)，對多環(huán)芳烴菲具有較高的降解率，12d的菲降解率達到82.86%，適量菲的添加能夠刺激菌體產(chǎn)酶，并且該菌株對高濃度菲的耐受性很強，在高濃度菲的條件下生長狀況良好。

圖11 不同起始菲濃度條件下菲降解率和生物量Fig.11 Phenanthrene degradation rate and biomass under different initial concentration conditions

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Optimization of culture conditions of Pleurotus eryngii for laccase production and its degradation characteristics of phenanthrene

GE Fei1，ZHANG Hui-min1，GONG Qian1，ZHU Long-bao1，LI Wan-zhen1，GUI Lin2
（1.Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation Anhui Province，Anhui Polytechnic University，Wuhu 241000，China；2.Department of Microbiology and Immunology，Wannan Medical College，Wuhu 241000，China）

Based on the single factor experiment，using Box-Behnken experimental design method，the enzyme activity of laccase as response value，the fermentation conditions were optimized and the feasibility of experiment model was validated.The results indicated optimal ingredients including：the speed at 131r/min，temperature at 27.6℃ and shake loading at 32mL/100mL.Under the optimal conditions，the strain of Pleurotus eryngii had higher degradation rate of phenanthrene.The degradation rate of phenanthrene reached 82.86%at the 12th day.

Pleurotus eryngii；laccase；culture conditions；response surface methodology；phenanthrene

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0221-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.040

2013－10－24

葛飛（1978-），男，博士，副教授，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

安徽省高等學校優(yōu)秀青年人才基金項目（2011SQRL079）；安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2013A049）。