米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件優(yōu)化與分離純化

史文婷，劉　寅，趙　越，毛多斌，楊雪鵬（鄭州輕工業(yè)學(xué)院，食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450000）

米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件優(yōu)化與分離純化

史文婷，劉寅，趙越，毛多斌，楊雪鵬*
（鄭州輕工業(yè)學(xué)院，食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450000）

通過單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)一株產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的米曲霉搖瓶發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，其最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度24℃，轉(zhuǎn)速161r/min，裝液量50mL/250mL，起始pH5.0，接種量1%，發(fā)酵時(shí)間96h。在該條件下，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活力達(dá)到33.07U/mL，較優(yōu)化前提高64.6%。通過Desalting脫鹽柱，DEAE FF陰離子柱和SepHacryl S-100 HR凝膠柱等分離純化步驟，經(jīng)SDS-PAGE檢測，該酶呈現(xiàn)一條帶，純化倍數(shù)、酶的比活力和收率分別為29.35、231.14U/mg和48.9%。經(jīng)薄層層析檢測，該酶能夠生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），證明該酶為果糖基轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)計(jì)算，該酶分子量約為92.8ku。

米曲霉，果糖基轉(zhuǎn)移酶，優(yōu)化，分離純化

圖1　受體反應(yīng)示意圖Fig.1　The graph of acceptor reaction

隨著人們生活水平的提高，果聚糖（FOS）這類保健糖的需求量不斷增大。工業(yè)上，通常采用酶法生產(chǎn)FOS，其原理為果糖基轉(zhuǎn)移酶催化裂解蔗糖形成葡萄糖和酶與果糖的過渡態(tài)復(fù)合物，復(fù)合物受到親核化合物攻擊時(shí)果糖基轉(zhuǎn)移到不同的受體上生成不同的果糖苷或果糖，這種反應(yīng)稱為受體反應(yīng)（Acceptor reaction），如圖1所示，其中，INV（Invertase）表示轉(zhuǎn)化酶，1-SST（Fructosyltransferase）表示果糖基轉(zhuǎn)移酶，G表示葡萄糖，F(xiàn)表示果糖[1]。近期有關(guān)低聚果糖功能的研究較多，例如胡曉燕、郝選明研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充低聚果糖可以改善甚至逆轉(zhuǎn)6周遞增負(fù)荷訓(xùn)練引起的大鼠一系列機(jī)能下降現(xiàn)象，表明其對(duì)免疫抑制有顯著調(diào)節(jié)作用[2]；王乃強(qiáng)、李國慶等研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖能夠顯著提高小鼠對(duì)鈣離子的吸收效率，為低聚果糖在補(bǔ)鈣食品行業(yè)中的應(yīng)用提供理論支持[3]；劉曉梅、彭芝榕等研究發(fā)現(xiàn)低聚果糖和乳酸桿菌均具有潤腸通便的作用并對(duì)維持腸道菌群平衡、抑制腸球菌和腸桿菌的生長有較好功效，其通便功用大小與藥物劑量濃度有關(guān)[4]。

本課題組前期篩選得到了米曲霉菌株，該菌株所產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)[5-7]，并能夠合成蔗糖-6-乙酸酯[8]，故通過采用薄層層析（TLC）技術(shù)檢測蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a）的生成來鑒定所得到的酶為果糖基轉(zhuǎn)移酶。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)米曲霉菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對(duì)發(fā)酵后酶液進(jìn)行分離純化，以期得到純度較高的酶，為后期進(jìn)行果糖基轉(zhuǎn)移酶受體反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)的微觀研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

米曲霉O-1由實(shí)驗(yàn)室保藏；蔗糖、葡萄糖、果糖、蔗果三糖、蔗果四糖、低聚果糖、葡萄糖-6-乙酸酯（g-6-a）、蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a）標(biāo)樣均購于Sigma公司；乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；馬鈴薯培養(yǎng)基蔗糖16g，馬鈴薯200g，磷酸氫二鉀0.2%，dH2O 1L。

Waters 1525 Binary型高效液相色譜儀美國Waters；AKTA explorer 10S型蛋白質(zhì)純化儀GE公司；DYCZ-24DN型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1粗酶液的制備取一支活化后的斜面，加入無菌水，制備成孢子懸液，取300μL孢子懸液加入100mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃，160r/min培養(yǎng)。用6層紗布將菌體過濾洗滌擰干后懸浮于最適緩沖液（pH6.0的磷酸-檸檬酸緩沖液），進(jìn)行超聲波破碎。破碎后經(jīng)10000r/min，離心60min，上清液即為粗酶液。

1.2.2酶活力測定取2mL 10%的蔗糖溶液（最適緩沖液配制），加入40μL酶液（以蔗果三糖的量不超過總糖的10%為宜）。50℃水浴振蕩反應(yīng)30min，沸水浴15min終止酶反應(yīng)，離心取上清液制備樣品。酶活力定義：50℃條件下，每分鐘催化蔗糖生成1μmol蔗果三糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活單位（U）。

酶活力=0.2×GF2%×1000/（0.504×t×V）[9]

式中：0.2—蔗糖總量（g）；GF2%—蔗果三糖的百分含量；0.504—1μmol蔗果三糖的含量（mg）；t—反應(yīng)時(shí)間（min）；V—上清酶液體積（mL）。

1.2.3糖的檢測檢測器：Waters 2424 ELS Detector；色譜柱：大連依利特NH2柱（250×4.6mm）；流動(dòng)相為乙腈-水（75∶25）；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃，分析時(shí)間30min。

1.2.4米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.4.1單因素實(shí)驗(yàn)單因素實(shí)驗(yàn)包括：起始pH、裝液量、接種量、溫度、轉(zhuǎn)速以及發(fā)酵時(shí)間，所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行。

1.2.4.2均勻設(shè)計(jì)利用單因素方差分析法分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響產(chǎn)酶顯著的四個(gè)因素進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)。選取的四個(gè)因素為裝液量、轉(zhuǎn)速、接種量和溫度，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，采用均勻設(shè)計(jì)表U5（54），見表1。其他培養(yǎng)條件：起始pH5.0，發(fā)酵時(shí)間96h。

1.2.5蛋白質(zhì)含量的測定參照文獻(xiàn)[10]。

表1　U5（54）均勻設(shè)計(jì)表Table 1　U5（54）uniform design table

1.2.6SDS電泳檢驗(yàn)參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.7酶的分離純化將發(fā)酵后的粗酶液30K中空纖維柱濃縮后，冷凍干燥成粉末，向粉末中加入適量的最適緩沖液，混勻后，依次通過Desalting脫鹽柱、DEAE FF陰離子柱和SepHacryl S-100 HR凝膠柱，流速為1.0mL/min，凝膠柱上樣量為10mL，其他兩個(gè)柱子上樣量均為1mL。脫鹽柱與凝膠柱均用最適緩沖液進(jìn)行洗脫，陰離子柱依次用pH6.0、5.0、4.0、3.0的磷酸-檸檬酸緩沖液進(jìn)行洗脫，最后用pH5.0磷酸-檸檬酸緩沖液（含1mol/L NaCl）洗脫?；厥崭鱾€(gè)純化步驟的吸收峰進(jìn)行酶活測定。

1.2.8薄層層析硅膠板為TLC Silica gel 60；層析液為正丁醇∶無水乙醇∶蒸餾水=5∶3∶2，展開兩次，顯示劑：5%硫酸甲醇。

2　結(jié)果與分析

2.1米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.1.1單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件

2.1.1.1裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響裝液量反映了菌株對(duì)溶氧的要求，在好氧培養(yǎng)中，氧氣的供應(yīng)往往是發(fā)酵過程能否成功的重要因素之一，氧氣不足時(shí)容易引起乙酸的積累從而影響菌體的生長和產(chǎn)酶量[12]。從圖2中可知，裝液量為20mL/250mL時(shí)酶活最高，其次為40mL/250mL，這可能因?yàn)樵撁浊乖谘鯕獬渥愕沫h(huán)境更有利于生長和產(chǎn)酶。由于兩者酶活相差不多，考慮到培養(yǎng)基的利用效率，故裝液量采用40mL/250mL。

圖2　裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2　Effect of loaded liquid on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.2接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響接種量決定著菌體的密集程度，適當(dāng)?shù)拿芗燃扔欣诰w的生成，也有利于產(chǎn)酶，若密集程度過高，反而會(huì)因?yàn)闋I養(yǎng)消耗太快或通氧量不足等問題使酶產(chǎn)量降低[13]。從圖3可知，隨著接種量的增加，酶活力的總體趨勢(shì)呈現(xiàn)先減小再增加再減少的過程，這也與上述的理論相符合。當(dāng)接種量為300μL/40mL時(shí)，由于此時(shí)的養(yǎng)分和溶氧最有利于菌體的生長于產(chǎn)酶，故果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力最大。

圖3　接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3　Effect of inoculum size on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響測定不同發(fā)酵時(shí)間培養(yǎng)的發(fā)酵液的酶活力，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，果糖基轉(zhuǎn)移酶酶活也呈現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96h時(shí)，酶活達(dá)到最大，之后酶活力開始降低，這可能由于發(fā)酵前期，米曲霉主要進(jìn)行自身繁殖生長，同時(shí)伴隨有果糖基轉(zhuǎn)移酶的生成，當(dāng)發(fā)酵到96h，此時(shí)米曲霉達(dá)到最大生物量，故產(chǎn)酶量最高，隨著發(fā)酵繼續(xù)進(jìn)行，米曲霉開始進(jìn)入衰亡期，故產(chǎn)酶量下降。因此，選擇96h作為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

圖4　發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4　Effect of fermentation time on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.4起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響pH主要從酶的活性，細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài)以及代謝過程等方面影響菌體生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)物合成，因此，采用不同起始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)米曲霉產(chǎn)酶進(jìn)行研究[14]，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)起始pH為5.0時(shí)酶活力最高，這表明該米曲霉在偏酸性的環(huán)境中能夠更好生長與產(chǎn)酶。

2.1.1.5溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響溫度主要從發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性，菌體代謝產(chǎn)物合成方向，微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)酵液的理化性質(zhì)等方面來影響產(chǎn)物的合成[15]。當(dāng)溫度升高時(shí)，米曲霉的代謝加快，這就加速酶的產(chǎn)生，但是當(dāng)溫度超出了米曲霉的最適溫度時(shí)，由于米曲霉的代謝受到一定程度的限制，從而使產(chǎn)酶量下降。通過對(duì)溫度因素的考察，結(jié)果如圖6所示。從圖6中可知，當(dāng)溫度為28℃時(shí)，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力最高，這說明，當(dāng)溫度達(dá)到28℃時(shí)，米曲霉生長代謝最為旺盛，產(chǎn)酶量最多，故酶活最高。

圖5　起始pH對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5　Effect of initial pH on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

圖6　溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6　Effect of temperature on fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

2.1.1.6轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶的影響轉(zhuǎn)速與裝液量均為影響溶氧的重要因素，因此對(duì)轉(zhuǎn)速的研究也十分重要。從圖7中可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150r/min時(shí)，米曲霉所產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活達(dá)到最大，這說明該轉(zhuǎn)速下，發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧量更加有利于米曲霉菌體的生長，故酶活最高。

圖7　轉(zhuǎn)速對(duì)米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的影響Fig.7　Effect of rotate speed on fructosyltransferase production produced by Aspergillus oryzae

2.1.2均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)經(jīng)過均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表2　均勻?qū)嶒?yàn)結(jié)果Table 2　The result of uniform design

通過DPS軟件進(jìn)行回歸分析，得到酶活大小（Y）與各因素（X）之間的關(guān)系方程為Y=63.567+0.006X3-1.394X4+0.0000076X32，相關(guān)系數(shù)R=0.999，F(xiàn)=5282.71，p=0.0101。各因素的最佳組合為：裝液量50mL/250mL，轉(zhuǎn)速161r/min，接種量500μL（1%），溫度24℃，理論酶活可達(dá)35.14U/mL。根據(jù)DPS軟件回歸分析的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液酶活為33.07U/mL，與理論值相符。通過優(yōu)化，酶活力較優(yōu)化前提高了64.6%，這說明該優(yōu)化是行之有效的，這為后面進(jìn)行酶的分離純化奠定了良好的基礎(chǔ)。

2.2酶的分離純化

分離純化步驟結(jié)果見表3。

從表3中可以看出，經(jīng)過分離純化，酶的比活力達(dá)到231.14U/mg，純化倍數(shù)達(dá)到29.35，收率為48.9%。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可知，所純化的樣品呈現(xiàn)一條帶。經(jīng)計(jì)算[11]，該米曲霉果糖基轉(zhuǎn)移酶的相對(duì)分子質(zhì)量大致為92.8ku。

圖8　SDS-PAGE電泳圖Fig.8　SDS-PAGE pattern of the purified protease from Aspergillus oryzae

對(duì)分離純化后得到的純酶液進(jìn)行薄層層析（TLC），檢測其能否催化蔗糖生成s-6-a，結(jié)果見圖9。如圖9所示，經(jīng)過一系列純化步驟后，得到的電泳純的酶液能夠催化葡萄糖-6-乙酸酯（g-6-a）生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），故證明了該純化后的酶液為果糖基轉(zhuǎn)移酶。

圖9　純酶的蔗糖-6-乙酸酯檢測Fig.9　The detection of s-6-a for fructosyltransferase after purification

3　結(jié)論

經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)一株米曲霉產(chǎn)果糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)的產(chǎn)酶條件：裝液量50mL/250mL，接種量1%，溫度24℃，轉(zhuǎn)速161r/min，起始pH5.0，培養(yǎng)時(shí)間96h。通過優(yōu)化，果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活力可高達(dá)33.07U/mL，較之前提高了64.6%。將優(yōu)化后粗酶液進(jìn)行超濾、凝膠柱層析等純化過程，得到了電泳純的酶液，純化倍數(shù)、比活力和收率分別為29.35、231.14U/mg和48.9%。經(jīng)薄層層析檢測，該純化后的酶液能夠生成蔗糖-6-乙酸酯（s-6-a），故證明純化后的酶液為果糖基轉(zhuǎn)移酶。經(jīng)計(jì)算，該酶的分子量為92.8ku，與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果較為接近[16-18]。

為了對(duì)該酶進(jìn)行動(dòng)力學(xué)、熱力學(xué)反應(yīng)研究以及酶的應(yīng)用研究，擬對(duì)純化后的酶進(jìn)行進(jìn)一步的氮端測序，以期采用基因工程的方法獲得大量的純酶。

表3　果糖基轉(zhuǎn)移酶各純化步驟結(jié)果Table 3　Separation and purification of fructosyltransferase

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Fermentation conditions optimization and purification of fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae

SHI Wen-ting，LIU Yin，ZHAO Yue，MAO Duo-bin，YANG Xue-peng*
（Food and Bioengineering College，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450000，China）

The optimal fermentation conditions of fructosyltransferase produced by Aspergillus oryzae was studied by single-factor experiment and uniform design.The optimized conditions was temperature 24℃，rotation rate 161r/min，medium volume 50mL/250mL，initial pH5.0 and inoculum size 1%.The highest enzyme activity was 33.07U/mL after 96h，64.6%higher than before.The fructosyltransferase was separated and purified by using a procedure including column chromatography separation by Desalting，DEAE FF and SepHacryl S-100 HR.The final purified fold，specific activity and yield of the purified enzyme were 29.35，231.14U/mg and 48.9%，respectively.The purified enzyme was confirmed to be homogeneous by SDS-PAGE.Detected by thin layer chromatography（TLC），the enzyme was able to generate sucrose-6-acetate（s-6-a），as proof of fructosyltransferase.Its molecular weight was estimated to be 92.8ku.

Aspergillus oryzae；fructosyltransferase；optimization；purification

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0211-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.038

2013－09－27*通訊聯(lián)系人

史文婷（1989-），女，碩士研究生，主要從事酶工程方面的研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20676127）；河南省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（102102110044）。