乳酸片球菌PA003發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

董 婷，周志江，韓 燁（天津大學化工學院，天津300072）

乳酸片球菌PA003發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化

董 婷，周志江*，韓 燁
（天津大學化工學院，天津300072）

為獲得生產(chǎn)用乳酸片球菌廉價發(fā)酵培養(yǎng)基，采用單因素實驗和正交實驗的方法，對乳酸片球菌PA003的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分為：糖蜜2%、豆餅粉2%、玉米浸提液0.3%、磷酸氫二鉀0.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.025%、吐溫80 0.1%；最佳發(fā)酵條件為：接種量6%、pH6.5、溫度37℃、培養(yǎng)時間14h、轉(zhuǎn)速140r/min。采用上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，乳酸片球菌發(fā)酵液菌落總數(shù)為6.4×109CFU/mL，與采用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)時的菌落數(shù)相當，故顯示出了良好的工業(yè)化應用前景。

乳酸片球菌，發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵條件，單因素實驗，正交實驗

乳酸片球菌PA003是從東北發(fā)酵酸菜中分離出的一株對單核細胞增多癥李氏桿菌有抑制作用的片球菌素產(chǎn)生菌株[1]，近年來其在食品發(fā)酵和食品保藏中所發(fā)揮的作用備受關注[2]。Gardner等用植物乳桿菌、乳酸片球菌和腸膜狀明串珠菌制成混合發(fā)酵劑進行蔬菜發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)其過程與自然發(fā)酵過程相似，但產(chǎn)酸速率加快，乙醇產(chǎn)量降低，發(fā)酵產(chǎn)品保質(zhì)期延長[3]。美國專利4，883，673、4，929，445、5，219，603分別提供了一種用乳酸片球菌產(chǎn)生的細菌素抑制色拉和色拉調(diào)味料中微生物腐敗的方法、抑制單核細胞增多癥李氏桿菌的方法、延長生肉和肉制品貨架期的方法[4-6]。乳酸片球菌的抑菌機理主要是由于其分泌的片球菌素具有殺死病源菌并抑制與其種屬相近的病原微生物的作用[7]。此外，它產(chǎn)生乳酸，使環(huán)境pH下降，對某些不耐酸的細菌也有抑制作用。將活菌直接作為生物防腐劑添加到食品中，國內(nèi)外已有相關的報道，如將產(chǎn)抗菌素的乳酸菌組合應用添加到牛肉中可抑制其中單核細胞增多癥李氏桿菌的生長[8]?？梢娙樗崞蚓鷮μ岣呤称返陌踩院脱娱L食品貨架期有廣闊的應用前景，然而由于它的培養(yǎng)仍然處于實驗室階段，對于菌體的培養(yǎng)主要通過MRS培養(yǎng)基來實現(xiàn)，該培養(yǎng)基成分復雜，食用安全性尚未確定，且原料成本較高，考慮到中試實驗和后期大規(guī)模生產(chǎn)的效益問題，有必要選擇一種簡單安全、成本低廉的培養(yǎng)基[9]。

本實驗擬從工業(yè)化生產(chǎn)的角度出發(fā)，以價格低廉的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物糖蜜和豆餅粉為碳源和氮源，對培養(yǎng)基的成分和發(fā)酵條件進行單因素分析和正交實驗，以期獲得低成本、高效率的乳酸片球菌發(fā)酵培養(yǎng)基，為實現(xiàn)乳酸片球菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸片球菌PA003 從東北發(fā)酵酸白菜中分離獲得[1]；MRS培養(yǎng)基 葡萄糖2%，胰蛋白胨1%，牛肉膏0.8%，酵母膏0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫80 0.1%，pH6.2～6.5；玉米浸提液、糖蜜、豆餅粉、乳清粉、玉米漿 購于天津化工經(jīng)銷部。

7230G可見分光光度計 購于上海精科公司；QE-1臺式恒溫振蕩器 購于天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化 將甘油保存的乳酸片球菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，50mL搖瓶，裝液量10mL，37℃下分別以120r/min搖床培養(yǎng)14h[10]。

1.2.2 乳酸片球菌生長曲線的測定 取1.2.1中活化好的乳酸片球菌種子液，以2%的接種量接種于液體MRS培養(yǎng)基中，50mL搖瓶，裝液量10mL，37℃下分別以120r/min搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣，稀釋后，利用可見分光光度計測OD值，所用波長為600nm。

1.2.3 培養(yǎng)基組成成分的確定 除替換碳源、氮源外，其余成分均按照MRS培養(yǎng)基的固有配方，即磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫80 0.1%，培養(yǎng)基初始pH6.2～6.5，接種量為2%，50mL搖瓶，裝液量10mL，37℃下?lián)u床培養(yǎng)14h。

1.2.3.1 不同碳源對乳酸片球菌OD值的影響 以MRS培養(yǎng)基為參考，分別以2%的葡萄糖、糖蜜、蔗糖、乳清粉為碳源，2.5%胰蛋白胨為氮源，另加0.1%玉米浸提液，其余成分均按照MRS培養(yǎng)基的固有配方和發(fā)酵條件，測定不同碳源下發(fā)酵液的菌體OD值。

1.2.3.2 不同氮源對乳酸片球菌OD值的影響 以MRS培養(yǎng)基為參考，分別以2.5%胰蛋白胨、豆餅粉、酵母粉，玉米漿為氮源，2%糖蜜為碳源，另加0.1%玉米浸提液，其余成分均按照MRS培養(yǎng)基的固有配方和發(fā)酵條件，測定不同氮源下發(fā)酵液的菌體OD值。

1.2.3.3 不同碳氮比對乳酸片球菌OD值的影響 采用糖蜜作為碳源，豆餅粉作為氮源，分別采用碳氮比V（糖蜜）∶V（豆餅粉）=2∶1、1∶2、2∶2、2∶2.5、2∶3，另加0.1%玉米浸提液，其余成分均按照MRS培養(yǎng)基的固有配方和發(fā)酵條件，測定不同碳氮比下發(fā)酵液的菌體OD值。

1.2.3.4 培養(yǎng)基組成正交實驗 選取糖蜜、玉米浸提液、豆餅粉三個因素，每個因素選三個水平進行正交實驗L9（34），探究培養(yǎng)基組分對乳酸片球菌OD值的影響，因素水平設計見表1。

1.2.4 發(fā)酵條件的確定

1.2.4.1 培養(yǎng)基初始pH對乳酸片球菌OD值的影響配制初始pH分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的改良后的MRS廉價培養(yǎng)基，其他條件不變，測定不同pH條件下發(fā)酵液的菌體OD值。

表1 培養(yǎng)基組成成分正交因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal experiment on medium composition

1.2.4.2 接種量對乳酸片球菌OD值的影響 選取接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%，接種于改良后的MRS廉價培養(yǎng)基中，其他條件不變，測定不同接種量下發(fā)酵液的菌體OD值。

1.2.4.3 溫度對乳酸片球菌OD值的影響 設定搖瓶培養(yǎng)溫度分別為20、25、32、37、42℃，將PA003接種于改良后的MRS廉價培養(yǎng)基中，其他條件不變，測定不同溫度條件下發(fā)酵液的菌體OD值。

1.2.4.4 轉(zhuǎn)速對乳酸片球菌OD值的影響 設定其他條件不變，分別以100、120、140、160、180r/min的轉(zhuǎn)速，搖床培養(yǎng)PA003，測定不同轉(zhuǎn)速下發(fā)酵液的菌液OD值。

1.2.4.5 發(fā)酵條件正交實驗 選取初始pH、接種量、溫度三個因素進行正交實驗L9（34），因素水平表設計見表2。

表2 發(fā)酵條件正交實驗因素水平表Table 2 Factor and level of orthogonal experiment on fermentation conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸片球菌的生長曲線

將種子液接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)，每隔2h取樣，測菌體OD值，得到乳酸片球菌的生長曲線如圖1所示。

圖1 乳酸片球菌PA003的生長曲線Fig.1 The growth curve of Pediococcus acidilactici PA003

由圖1可知，在0～2h之間，乳酸片球菌PA003經(jīng)過一個短暫的延滯期后，很快進入對數(shù)生長期，大約在14h時，菌體密度和乳酸片球菌素的產(chǎn)量及抑菌活性均達到最大值。隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，有害代謝產(chǎn)物的積累，細菌繁殖速度逐漸下降，細菌的增殖數(shù)與死亡數(shù)漸趨平衡，此時進入穩(wěn)定期。穩(wěn)定期后細菌繁殖越來越慢，死亡菌數(shù)增加，有的細菌甚至出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，生理代謝活動也趨于停滯，此時細菌進入衰亡期。由于OD值表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長曲線的衰亡期不明顯。

2.2 培養(yǎng)基組成成分的確定

2.2.1 不同碳源對乳酸片球菌OD值的影響 分析該菌對碳源利用的結(jié)果表明，乳酸片球菌在以糖蜜為碳源時生長情況最好，OD值可達1.931，葡萄糖、蔗糖次之，乳清粉最差。其結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同碳源對乳酸片球菌OD值的影響Fig.2 The effect on OD of Pediococcus acidilactici by different carbon sources

2.2.2 不同氮源對乳酸片球菌OD值的影響 不同氮源對乳酸片球菌OD值的影響如圖3所示，結(jié)果表明：乳酸片球菌以豆餅粉為氮源時生長情況最好，OD值可達1.969，胰蛋白胨、玉米漿次之，酵母粉最差。

圖3 不同氮源對乳酸片球菌OD值的影響Fig.3 The effect on OD of Pediococcus acidilactici by different nitrogen sources

2.2.3 不同碳氮比對乳酸片球菌OD值的影響 以糖蜜作為碳源，以豆餅粉作為氮源，測定不同碳氮比對乳酸片球菌OD值的影響，實驗結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明：當碳氮比為2∶3時，乳酸片球菌的生長情況最好，OD值可達1.803。但不同碳氮比對乳酸片球菌OD值的影響區(qū)別不大。

圖4 不同碳氮比對乳酸片球菌OD值的影響Fig.4 The effect on OD of Pediococcus acidilactici by different C/N ratio

2.2.4 培養(yǎng)基組成成分正交實驗結(jié)果 培養(yǎng)基組成成分正交實驗結(jié)果見表3。由表3可知，對乳酸片球菌生長情況影響最大的因素依次為A（糖蜜）＞B（玉米浸提液）＞C（豆餅粉）。由極差分析可知，乳酸片球菌的最佳培養(yǎng)基配方為A2B3C1，此時乳酸片球菌的菌體OD值為1.914，即糖蜜2%，玉米浸提液0.3%、豆餅粉2%時，可取得菌體密度較大的乳酸片球菌增殖培養(yǎng)液。

表3 培養(yǎng)基組成成分正交實驗結(jié)果和分析Table 3 Test result and analysis of orthogonal experiment on components of medium

2.3 發(fā)酵條件確定

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH對乳酸片球菌OD值的影響 對該菌生長的起始pH進行分析，結(jié)果如圖5所示。實驗結(jié)果表明：在pH5.0～6.5該菌的生物量呈遞增趨勢，且在pH6.5處達到最大值，此時OD值為1.749，培養(yǎng)基初始pH超過6.5時，該菌的菌體密度開始下降，說明乳酸片球菌較適宜在偏酸性的環(huán)境中生長。

2.3.2 接種量對乳酸片球菌OD值的影響 通過測定不同接種量對該菌OD值的影響可知，接種量對乳酸片球菌的生物量影響較大，實驗結(jié)果如圖6所示。接種量在2%～6%范圍內(nèi)，該菌的生物量呈遞增趨勢，當接種量為6%時，該菌的菌體密度達到最大，此時的OD值為1.775，接種量超過6%之后，菌體密度增加不明顯，甚至有減少的趨勢。

2.3.3 溫度對乳酸片球菌OD值的影響 培養(yǎng)溫度對乳酸片球菌生物量的影響如圖7所示，溫度在37℃時，發(fā)酵液的菌體密度達到最大值，此時OD值為1.763。培養(yǎng)溫度高于該溫度時，菌體密度下降。說明乳酸片球菌的最適生長溫度為37℃。

圖5 培養(yǎng)基初始pH對乳酸片球菌OD值的影響Fig.5 Effect of initial pH on OD of Pediococcus acidilactici

圖6 培養(yǎng)基初始pH對乳酸片球菌OD值的影響Fig.6 Effect of inoculum on OD of Pediococcus acidilactici

圖7 溫度對乳酸片球菌OD值的影響Fig.7 Effect of temperature on OD of Pediococcus acidilactici

2.3.4 轉(zhuǎn)速對乳酸片球菌OD值的影響 轉(zhuǎn)速對乳酸片球菌生物量的影響如圖8所示，轉(zhuǎn)速在100～140r/min范圍內(nèi)，培養(yǎng)液的菌體密度呈增大趨勢，在140r/min時菌體密度達到最大值，此時OD值為1.767，當轉(zhuǎn)速高于140r/min時，菌體密度開始下降。但是當轉(zhuǎn)速大于120r/min時，增大轉(zhuǎn)速對乳酸片球菌的OD值的影響區(qū)別不大，說明140r/min的轉(zhuǎn)速可以滿足乳酸片球菌生長對氧氣的需求。

圖8 轉(zhuǎn)速對乳酸片球菌OD值的影響Fig.8 Effect of speed on OD of Pediococcus acidilactici

2.3.5 發(fā)酵條件正交實驗結(jié)果 發(fā)酵條件正交實驗結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明：影響乳酸片球菌OD值的因素按主次順序依次為C＞A＞B，即溫度對OD值的影響最大，pH次之，接種量的影響最小。由極差分析可知，乳酸片球菌工業(yè)培養(yǎng)的最佳發(fā)酵條件為A3B1C2。即pH6.5，接種量6%，培養(yǎng)溫度37℃時，乳酸片球菌的菌體密度OD值最大，經(jīng)驗證實驗測定得出其OD值為1.935，高于表4中其他組合的OD值。采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成成分和發(fā)酵條件對乳酸片球菌PA003進行培養(yǎng)，做三次平行實驗，經(jīng)平板計數(shù)后得出其菌落數(shù)為6.4×109CFU/mL，而用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸片球菌，經(jīng)平板計數(shù)后得出其菌落總數(shù)為6.7×109CFU/mL，二者比較可知，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸片球菌的生物量與經(jīng)典MRS培養(yǎng)基相當，且成本降低了1300元/t，因此具有很好的工業(yè)開發(fā)價值。

表4 發(fā)酵條件正交實驗結(jié)果與分析Table 4 Test result and analysis of orthogonal experiment on fermentation conditions

3 結(jié)論與討論

食品安全問題頻繁發(fā)生已成為我國現(xiàn)代化建設過程中備受關注的社會問題，它不僅關系到人們的身心健康，也關系到食品產(chǎn)業(yè)是否能蓬勃發(fā)展，甚至關系到我國的國際聲譽。微生物的污染是導致食品安全性下降的主要原因，食品受病原微生物污染后引起食源性疾病，受腐敗微生物的污染會發(fā)生不同程度的腐敗變質(zhì)。在控制食品中病原性和腐敗性微生物方面，近幾年研究最廣泛的是乳酸片球菌及其產(chǎn)生的片球菌素，片球菌素被認為是繼nisin之后第二個有望用于食品工業(yè)的細菌素，而且有關研究指出，乳酸片球菌能夠定居到動物和人的消化道，作為潛在的益生菌顯示出了良好的應用前景[11-12]。

在國內(nèi)，主要是本研究室在進行乳酸片球菌和片球菌素的研究，乳酸片球菌活菌制劑和片球菌素純化生產(chǎn)技術均處于小試階段，對于菌體的培養(yǎng)主要通過MRS培養(yǎng)基來實現(xiàn)，該培養(yǎng)基成分復雜，原料成本較高，為此有必要對乳酸片球菌和片球菌素的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進行研究，這種做法符合國際上該領域研究和發(fā)展的趨勢，也符合我國逐步淘汰高毒、高殘留、高副作用食品防腐劑和飼料添加劑的產(chǎn)業(yè)方針，對提高我國食品安全水平意義深遠。我國糖蜜和豆餅粉資源豐富，其中糖蜜是制糖工業(yè)的副產(chǎn)品，含有大量的可發(fā)酵糖，可用作微生物發(fā)酵的碳源，也可用作某些食品的原料和動物飼料。豆餅粉是大豆榨油后的副產(chǎn)物，含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸，可用作微生物發(fā)酵的氮源，也可用于制作糕點食品、健康食品以及化妝品和抗菌素原料。與蛋白胨和牛肉膏等有機氮源相比，豆餅粉成本低廉，易于獲得，更能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要[13]。因此本實驗選用糖蜜和豆餅粉作為乳酸片球菌工業(yè)發(fā)酵的有機碳源和氮源，采用正交實驗的方法對乳酸片球菌生長的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，進而獲得高濃度的菌體，為進行高密度工業(yè)化培養(yǎng)并最終形成乳酸片球菌制劑奠定一定的理論和實踐基礎[14]。

乳酸片球菌PA003是從東北發(fā)酵酸白菜中分離的一株對單核細胞增多癥李氏桿菌有抑制作用的菌株，經(jīng)瓊脂擴散實驗證明該菌有產(chǎn)生乳酸片球菌素的能力。為獲得該菌的生產(chǎn)用廉價型發(fā)酵培養(yǎng)基，采用單因素實驗和正交實驗的方法，對發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以可見分光光度計測定該菌發(fā)酵液的菌體密度。實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)基最佳組成成分為：糖蜜2%，豆餅粉2%，玉米浸提液0.3%，磷酸氫二鉀0.2%，乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%，硫酸鎂0.058%，硫酸錳0.025%，吐溫80 0.1%；最佳發(fā)酵條件為：接種量6%，pH6.5，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間14h，轉(zhuǎn)速140r/min。采用上述培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，乳酸片球菌發(fā)酵液的菌落總數(shù)為6.4×109CFU/mL，而用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)的乳酸片球菌，經(jīng)平板計數(shù)后得出其菌落總數(shù)為6.7×109CFU/mL，二者所得乳酸片球菌的生物量相當，而優(yōu)化后的培養(yǎng)基主要成分為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物，成本低廉易于獲得，比MRS培養(yǎng)基節(jié)省1300元/t，因此顯示了良好的工業(yè)化應用前景，為以后大規(guī)模生產(chǎn)乳酸片球菌發(fā)酵劑提供了實驗基礎和理論依據(jù)。

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Optimization of fermentation medium and fermentation conditions for Pediococcus acidilactici PA003

DONG Ting，ZHOU Zhi-jiang*，HAN Ye
（School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

In order to obtain a low-cost fermentation medium for Pediococcus acidilactici PA003 in a large scale，the fermentation medium and fermentation conditions were optimized by single factor test and orthogonal test.The results showed that the best compositions of fermentation medium were 2%of molasses，2%of soybean powder，0.3%of corn extraction solution，0.2%of dipotassium hydrogen phosphate，0.5%of sodium acetate，0.2%of ammonium citrate，0.058%of magnesium sulfate，0.025%of manganese sulfate，and 0.1%of Tween 80，and the pH of the medium was 6.5.The results also indicated that the best fermentation inoculum size was 6%，incubation temperature at 37℃and time for 14h，speed at 140r/min.The biomass of Pediococcus acidilactici in such conditions reached 6.4×109CFU/mL，which was equivalent to the biomass in MRS medium. The results of this study suggested good application prospect in industry.

Pediococcus acidilactici；fermentation medium；fermentation conditions；single factor test；orthogonal test

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0192-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.034

2013－11－05 *通訊聯(lián)系人

董婷（1989-），女，碩士研究生，主要從事食品微生物方面的研究。

天津市科技計劃項目（13ZCZDNC01900）。