一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的研究

查小紅，楊廣明，田亞平（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

一種天然材料復(fù)合體系固定化酒用雙功能酶的研究

查小紅，楊廣明，田亞平*
（江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122）

運用吸附包埋交聯(lián)的復(fù)合方法固定化普羅威登斯菌Providencia sp.JNB815所產(chǎn)的具有降解尿素和氨基甲酸乙酯活性的雙功能酶。以尿素降解酶活性為指標(biāo)，單因素優(yōu)化固定化條件為：殼聚糖和明膠濃度分別為4.0%、2.0%，京尼平濃度0.4%，30℃恒溫水浴振蕩6h進行交聯(lián)，交聯(lián)后的微球固定化酶的時間為8h。固定化酶催化氨基甲酸乙酯（EC）和尿素反應(yīng)時，最適pH分別為4.5和4.0，最適溫度分別為60、40℃。固定化EC降解酶酶活在溫度20～60℃，pH5.0～6.5之間相對穩(wěn)定；固定化脲酶酶活在溫度20～50℃，pH4.0～6.5之間相對穩(wěn)定。固定化酶重復(fù)使用10次后，對尿素和EC的酶活殘留率分別為80%和30%。在32℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min的條件下，固定化尿素降解酶加酶量為0.04U/mL黃酒時，固定化酶處理黃酒20h后，尿素去除率可達93.03%；同樣條件下，黃酒中固定化EC降解酶加酶量為0.17U/mL時，處理黃酒20h后，EC去除率可達56.60%。GC-MS結(jié)果顯示固定化酶處理后的黃酒風(fēng)味物質(zhì)變化不大。

固定化，雙功能酶，黃酒，氨基甲酸乙酯

氨基甲酸乙酯（EC），是2A類致癌性的物質(zhì)，微量存在于大部分發(fā)酵食品和酒精飲料中[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)黃酒中90%氨基甲酸乙酯主要由尿素和乙醇經(jīng)化學(xué)反應(yīng)生成的[3]，因此利用脲酶將飲料酒中的尿素及時除去對于控制酒中氨基甲酸乙酯的生成具有重要意義。采用酒用酸性脲酶處理煎酒前的黃酒，可除去黃酒中大部分尿素，減少生成EC的可能性[4-5]，而EC降解酶則能直接有效的分解成品黃酒中已經(jīng)產(chǎn)生的EC[6-7]。

已有研究報道腸桿菌Enterobacter sp.R-SYB082能產(chǎn)生一種酸性脲酶具有雙重作用，可實現(xiàn)同時去除黃酒中底物尿素及產(chǎn)物EC[8]。本實驗室篩選出一株P(guān)rovidencia sp.JNB815，這株菌所產(chǎn)酶也具有同時降解尿素和EC的活性。粗酶液經(jīng)過純化后，初步證實降解EC和尿素活性的酶為同一種雙功能酶。將這一種雙功能酶進行固定化，可應(yīng)用在黃酒中同時去除尿素和EC，且可以分離回收再利用。殼聚糖作為固定化載體具有蛋白質(zhì)親和性高；分子中反應(yīng)基團多，可被用來進行化學(xué)改性；生物相容性好，安全無毒，廉價易得等優(yōu)點[9]。京尼平替代傳統(tǒng)的交聯(lián)劑戊二醛，由于它是從梔子苷中提取，具有天然無毒的特點，是一種良好的明膠殼聚糖交聯(lián)劑[10-12]。本文以殼聚糖明膠為載體，京尼平為交聯(lián)劑，用吸附-包埋-交聯(lián)的復(fù)合固定化方法對該酶進行固定化研究，并分別考察兩種底物條件下固定化雙功能酶的特性表征。在此基礎(chǔ)上，考察了固定化酶的不同應(yīng)用形式在黃酒中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Providenciasp.JNB815 本實驗室篩選，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號：CGMCC No.8326；殼聚糖 山東奧康生物科技有限公司；京尼平 江西撫川臨川之信生物科技有限公司；二乙酰一肟、硫代氨基脲、明膠 上海化學(xué)試劑廠；其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

722E型可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；HH-系列數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-2A型數(shù)顯測速恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電子天平 上海菁海儀器有限公司；超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 游離雙功能酶的提取 將菌種從甘油管接種至種子培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)10h，再按2%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24h。發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心5min，收集菌體，經(jīng)檸檬酸緩沖液洗滌數(shù)次后，離心獲得全細胞。用檸檬酸緩沖液稀釋細胞至原發(fā)酵液體積的1/10，攪勻，并進行超聲波破碎，條件為300W、15min（破碎時間3s、間隔時間3s），破碎液在4℃，10000r/min離心15min，收集上清液，即為粗酶液。

1.2.2 固定化雙功能酶的制備 稱取一定質(zhì)量的殼聚糖和明膠溶于100mL 1%的乙酸中，磁力攪拌使其充分溶解。用注射器將殼聚糖明膠溶液滴入凝結(jié)液中（20%的NaOH溶液和無水乙醇，體積比4∶1），制成微球，凝結(jié)一段時間后用去離子水洗至中性，并與一定濃度的京尼平溶液交聯(lián)。洗滌除去微球表面的交聯(lián)劑后，按一定比例向載體中加入雙功能酶溶液，冰箱中靜置一段時間進行固定。最后，洗滌微球至表面無游離酶為止。瀝干，4℃冷藏備用。

1.2.3 游離酶酶活測定 采用靛酚藍反應(yīng)比色法[13]。

酶活力定義：在常壓，37℃，pH4.5條件下，每分鐘分解尿素或氨基甲酸乙酯產(chǎn)生1滋mol氨為一個酶活力單位。尿素降解酶和EC降解酶活力的測定分別采用尿素和EC為底物。

1.2.4 固定化酶酶活測定 取一定質(zhì)量的殼聚糖微球加入一定體積檸檬酸緩沖液配制的尿素或氨基甲酸乙酯溶液中，在恒溫水浴箱中保溫20min后，過濾取其濾液，以下操作與游離酶活力測定相同，固定化酶活力定義同游離酶。

1.2.5 固定化率的測定 即酶活回收率，EC酶固定化率（%）=固定化EC酶總酶活/固定化時所加游離EC酶總酶活×100，脲酶固定化率（%）=固定化脲酶總酶活/固定化時所加游離脲酶總酶活×100。

1.2.6 固定化酶的條件優(yōu)化

1.2.6.1 殼聚糖和明膠質(zhì)量濃度的確定 將殼聚糖和一定質(zhì)量明膠溶入1%乙酸溶液中，形成1%、2%、3%、4%和5%的殼聚糖溶液，再將混合溶液滴入凝結(jié)液中制備殼聚糖微球，測定不同殼聚糖濃度下所得的固定化酶活。明膠濃度的確定方法同上。

1.2.6.2 交聯(lián)劑濃度和固定化時間的確定 殼聚糖明膠載體分別用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%的京尼平交聯(lián)，確定固定化尿素降解酶酶活最高時的交聯(lián)劑濃度。交聯(lián)后的載體與酶固定時，固定化時間為2、4、6、8、10h，確定酶活最高時的固定化時間。

1.2.6.3 加酶量的確定 固定化酶的加酶量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL/g載體，確定酶活最高時的加酶量。

1.2.7 固定化酶的性質(zhì)

1.2.7.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性 最適溫度：在20、30、40、50、60、70℃的條件下，分別測定固定化酶和游離酶活力，以兩者的最高酶活力為100%，計算相對酶活力；溫度穩(wěn)定性：在20～80℃范圍內(nèi)，固定化酶和游離酶每隔10℃分別保溫1h后，用pH4.5檸檬酸緩沖液清洗干凈，冰浴，在37℃條件下測定酶活，以同組實驗中最高的酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.2.7.2 最適pH和pH穩(wěn)定性 最適pH：用50mmol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉，配制成pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的檸檬酸緩沖液；用50mmol/L磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉，配制成pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的PBS緩沖液。用上述各種緩沖液分別配制成EC和尿素的底物溶液，37℃條件下測定酶活，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力；pH穩(wěn)定性：將游離酶和固定化酶置于上述不同pH的各種緩沖液中，37℃下放置1h后，取樣將pH調(diào)至最適反應(yīng)pH，37℃條件下測定以EC和尿素為底物的酶活，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。

1.2.7.3 重復(fù)使用性 固定化酶測定一次酶活后，用pH4.5的檸檬酸緩沖溶液清洗干凈，再次測定酶活，重復(fù)測定15次。

1.2.7.4 動力學(xué)特征參數(shù) 在游離酶和固定化酶的最佳酶活測定條件下，測定尿素濃度為10、20、30、40、50、60mmol/L時游離酶和固定化酶的酶活。并測定EC濃度為80、100、120、160、200、240mmol/L時游離酶和固定化酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作圖法取雙倒數(shù)分別作兩種底物條件下的1/v-1/s曲線，計算游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm。

1.2.8 尿素去除率測定方法 采用二乙酰一肟法[14]。

1.2.9 氨基甲酸乙酯去除率的測定 吸取酒樣8mL置于20mL的頂空瓶中，逐漸加入氯化鈉至飽和，旋緊瓶蓋，插入萃取頭，在70℃下，250r/min恒溫攪拌萃取45min。樣品萃取及進樣由德國Gerstel多功能進樣系統(tǒng)自動完成。上述頂空固相微萃取技術(shù)富集黃酒中的EC，再用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用進行定性定量分析[15-16]。

1.2.10 黃酒中風(fēng)味物質(zhì)的測定 采用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)[17]

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化酶的制備條件

2.1.1 殼聚糖和明膠質(zhì)量濃度對固定化尿素降解酶活性的影響 圖1結(jié)果表明，殼聚糖濃度為4%時，固定化酶活達到最大值。過大的殼聚糖濃度，使得微膠囊表面的聚電解質(zhì)膜更加致密，造成底物擴散困難，固定化酶活反而降低[18]。

圖1 殼聚糖濃度對固定化尿素降解酶活性的影響Fig.1 The effect of chitosan concentration on immobilized acid urease activity

表1 明膠濃度對固定化酸性脲酶酶活的影響Table 1 The effect of gelatin concentration on immobilized acid urease activity

明膠在殼聚糖微球中的作用主要是增大微球的韌性與硬度，由表1可知，隨著明膠濃度的提高，雖然微球強度有所提高，但是固定化酶酶活卻相應(yīng)降低?？赡苁怯捎诿髂z濃度增大時，顆粒機械強度變大、孔徑減小、不利于載體與酶充分接觸[19]，從而降低了固定化酶的活力。綜合這兩種因素，選取明膠濃度為2%。

2.1.2 交聯(lián)劑濃度和固定化時間對固定化尿素降解酶活性的影響 選擇京尼平（細胞毒性為常用交聯(lián)劑戊二醛的1/10000[20-21]）交聯(lián)殼聚糖和明膠。圖2結(jié)果表明，京尼平交聯(lián)的最適濃度為0.4%，當(dāng)京尼平濃度從0%增加到0.4%時，固定化酶的酶活顯著提高；但是，繼續(xù)提高其濃度時，酶活呈現(xiàn)降低趨勢。

圖2 京尼平濃度對固定化尿素降解酶活性的影響Fig.2 The effect of genipin concentration on immobilized acid urease activity

圖3 固定化時間對固定化尿素降解酶活性的影響Fig.3 The effect of immobilization time on immobilized acid urease activity

表2 加酶量對固定化尿素降解酶活性和回收率的影響Table 2 The effect of enzyme concentration on immobilized enzyme activity and activity recovery

由圖3可知，隨著固定化時間的延長，所吸附的脲酶量有所提高。固定化時間為8h時，固定化酶活達到最高值，繼續(xù)延長時間，固定化酶活力開始下降?？赡苁且驗檠娱L固定化時間有利于酶分子與殼聚糖微球充分接觸，從而與微球上的活性基團發(fā)生共價偶聯(lián)，而當(dāng)微球吸附酶量逐漸增大，微球網(wǎng)格上的酶分子之間較為擁擠，載體孔徑相應(yīng)變細，底物不易與酶充分接觸，酶整體的活力有所下降。

2.1.3 加酶量對固定化尿素降解酶活性和回收率的影響 由表2可知，固定化酶的酶活隨著加酶量的增大而提高，載體中加酶量為2.5mL/g時，尿素降解酶活性達到最大值，酶活回收率在80%以上。繼續(xù)增大加酶量，酶活會有所降低。其原因在于載體表面與酶結(jié)合的位點是有限的，過多的游離酶會使結(jié)合位點全部被占據(jù)，另外，過多的酶分子鍵合到載體上時，酶分子之間的距離變小，靜電斥力增加，使酶分子的活性部位受到一定的影響，酶活有所下降。

2.2 固定化雙功能酶的特性表征

2.2.1 溫度對固定化酶和游離酶活性的影響 由圖4（a）可知，固定化雙功能酶催化尿素和EC反應(yīng)的最適溫度分別為40℃和60℃，游離酶催化這兩種底物反應(yīng)的最適溫度分別為35℃和40℃。由圖4（b）可知，固定化酶催化尿素的酶活在20～50℃之間有較強的穩(wěn)定性，50℃保溫1h，其酶活仍能達到原始酶活的80%。固定化酶催化EC的酶活在20～60℃之間具有良好的穩(wěn)定性，60℃保溫1h，其酶活仍能達到原始酶活的95.2%。而游離酶對尿素和EC的酶活在50℃以上時，呈急劇下降的趨勢。說明游離酶經(jīng)固定化后熱穩(wěn)定性得到明顯提高。

圖4 溫度對固定化酶和游離酶活性的影響Fig.4 The effect of temperature on the acyivity of immobilized and free enzymes

2.2.2 pH對固定化酶和游離酶活性的影響 由圖5（a、b）可知，以EC為底物時，固定化酶的最適pH為4.5，游離酶的最適pH為5.0；以尿素為底物時，固定化酶和游離酶的最適pH分別為為4.0和4.5。相對于游離酶，固定化酶的最適pH向酸性范圍移動。由于黃酒的pH范圍為3.5～4.5[22]，與游離酶相比，固定化酶更適于在黃酒中應(yīng)用。

由圖5（c、d）可知，固定化雙功能酶催化EC反應(yīng)的pH穩(wěn)定范圍為5.0～6.5，在這個pH范圍內(nèi)保溫1h，酶活殘留率均為83%以上；固定化雙功能酶催化尿素反應(yīng)的酶活在pH4.0～6.5之間有較強的穩(wěn)定性，在這個pH范圍內(nèi)保溫1h，酶活殘留率均為88%以上。并且在同一種pH范圍內(nèi)，固定化酶的穩(wěn)定性比游離酶強。

圖5 pH對固定化酶和游離酶活性的影響Fig.5 The effect of pH on the acyivity of immobilized and free enzymes

2.2.3 固定化酶的重復(fù)使用性 如圖6所示，重復(fù)使用10次后，固定化酶降解EC和尿素的酶活分別保留原來的30%和80%。EC降解酶酶活和尿素降解酶酶活分別在使用8次和15次后衰減為原來的50%，說明固定化酶重復(fù)使用性較好。

2.2.4 固定化酶的動力學(xué)參數(shù) 按照1.2.7.4的方法分別配制不同濃度的EC和尿素底物，測定不同底物濃度下的酶反應(yīng)的初速度，以雙倒數(shù)作圖法作圖，Lineweaver-Burk曲線如圖7所示。

圖6 固定化酶的重復(fù)使用性Fig.6 The reusability of the immobilized enzymes

圖7 固定化酶和游離酶的Lineweaver-Burk曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plot of immobilized enzyme andfree enzyme

由圖7計算出，固定化酶和游離酶催化EC的Km分別為705.7825、183.8190mmol/L，Vm為0.6527、0.9713滋mol/min。催化尿素的Km分別為13.5409、5.9879mmol/L，Vm為0.9434、0.8351滋mol/min，而固定化酶的Km值增大，即固定化酶與底物的親和力變小。通常由于載體基質(zhì)的空間位阻，阻擋了底物尤其是大分子底物向酶活性中心靠攏，致使底物在酶活性中心的濃度降低，從而減小了酶對底物的親和性[23]。

2.3 固定化酶的應(yīng)用

2.3.1 固定化酶在反應(yīng)器中的應(yīng)用 在內(nèi)徑3cm，長12cm的柱子中，黃酒的固定化酶加量為37.5U/L，調(diào)節(jié)流速1mL/min，使400mL的酒樣流過反應(yīng)器，循環(huán)處理4次，測定每次過柱后的樣品尿素去除率。

如表3所示，黃酒中的初始尿素濃度為74.94mg/L，固定化酶首次可去除酒樣中50.8%的尿素，同一黃酒樣品循環(huán)過柱4次后，尿素去除率達96.92%。

表3 層析柱中固定化酶對黃酒的尿素去除率Table 3 Urea removal rate of the Chinese wine with immobilized enzyme packed in colume

2.3.2 固定化酶的尿素去除率和EC去除率 市售黃酒中加入25mg/L的尿素配制成黃酒樣品，每15mL樣品中加入不同酶量處理，在32℃搖床轉(zhuǎn)速100r/min的條件下反應(yīng)20h，二乙酰一肟法測定尿素含量。由表4可知，黃酒樣品中游離尿素降解酶加量為0.05U/mL和0.10U/mL時，尿素去除率分別為49.99%和73.30%；樣品中固定化尿素降解酶的加量為0.03U/mL和0.04U/mL時，尿素去除率分別為74.16%和93.03%。由2號樣品的測定結(jié)果可知，其中固定化載體對尿素具有一定的吸附作用。

表4 游離酶和固定化酶對黃酒樣品的尿素去除率Table 4 Urea removal rate of the free and immobilized enzyme in Chinese wine

表5 游離酶和固定化酶對黃酒樣品的EC去除率Table 5 EC removal rate of the free and immobilized enzyme in Chinese rice wine

市售黃酒中加入100滋g/L EC配制成黃酒樣品，每15mL樣品加入不同量酶處理，在32℃搖床轉(zhuǎn)速100r/min的條件下反應(yīng)20h，采用GC-MS法測定黃酒樣品的EC含量。由表5可知，黃酒樣品中游離EC降解酶加量為0.05U/mL和0.10U/mL時，EC去除率分別為39.49%和41.29%；樣品中固定化EC降解酶的加酶量為0.10U/mL和0.17U/mL時，EC去除率分別為46.06%和56.60%。由2號樣品的測定結(jié)果可知，其中固定化載體對EC也具有一定的吸附作用。

2.3.3 固定化酶處理后的黃酒風(fēng)味分析 上述固定化酶處理過的黃酒采用頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測定樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。由圖8的結(jié)果查數(shù)據(jù)庫可知，固定化處理前的黃酒含有47種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，處理后的黃酒含有45種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。用固定化酶處理后減少了2種醇類和1種醛類，分別是：丙醇、丁醇和龍葵醛二甲醇縮醛；增加了1種酯類，為棕櫚酸乙酯；變化的幾種物質(zhì)均含量極少，且不是影響黃酒風(fēng)味的主要物質(zhì)。由此可知，固定化酶處理之后，對黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)沒有太大影響，因而不影響黃酒的風(fēng)味。

圖8 黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)圖譜Fig.8 Map of volatile flavor substances in wine

3 結(jié)論

本文采用殼聚糖微球在一定優(yōu)化的最適條件下對Providenciasp.JNB815所產(chǎn)的具有脲酶和EC降解酶活性的雙功能酶進行固定化。固定化酶對溫度、pH的耐受性均有所提高。固定化酶應(yīng)用于黃酒中時，可去除其中的微量尿素和EC，且不影響黃酒的風(fēng)味，對黃酒中微量有害物質(zhì)的控制有著良好的效果。另外，本文使用殼聚糖-明膠-京尼平的無毒體系固定化酶，與傳統(tǒng)的戊二醛交聯(lián)法相比，此方法在食品工業(yè)中更具有應(yīng)用前景。進一步研究提高載體的強度以及固定化酶的反應(yīng)器形式，可為固定化酶的工業(yè)化創(chuàng)造良好的基礎(chǔ)。

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Study on an immobilized bifunctional enzyme applied in rice wine with natural materials

ZHA Xiao-hong，YANG Guang-ming，TIAN Ya-ping*
（Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

By using a compound method of adsorption，embedment and crosslink，a bifunctional enzyme produced by Providencia sp.JNB815 with both urease and urethanase activity was immobilized.With urea degrading activity as an indicator，the optimum immobilization conditions through single factor experiments were as follows：chitosan 4.0%，gelatin 2.0%，0.4%of genipin and the crosslink was conducted at 30℃ with concussion for 6h.Then the crosslinked microspheres were used to immobilize the enzyme for 8h.The optimum pH was 4.5 and 4.0，and the optimum temperature was 60℃ and 40℃，respectly when immobilized enzyme catalyzed urethane and urea.The immobilized enzyme activity to EC maintained stability when the temperature was in the range of 20～60℃ and pH 5.0 to 6.5.The immobilized enzyme activity to urea maintained stability when the temperature was in the range of 20～50℃and pH 4.0 to 6.5.It retained 80%and 30%of the original catalytic avtivity to urea and EC，respectively after being used 10 times.Under the condition of 32℃ and 100r/min，0.04U urease was added to per mL rice wine.After being processed for 20h，the removing rate of urea in wine reached 93.03%.Under the same condition，the removing rate of EC in wine was 56.60%after 20h，when the amount of urethanase added was 0.17U per mL wine.In addition，the treatment with immobilized enzyme showed neglectable effect on the detected flavor substances in the wine.

immobilization；bifunctional enzyme；wine；urethane

TS201.2

A

1002-0306（2014）14-0186-07

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.033

2013－10－24 *通訊聯(lián)系人

查小紅（1988-），女，碩士研究生，研究方向：工業(yè)微生物學(xué)與酶工程。

國家973計劃項目（2012CB720802）。