冷水魚(yú)腸道抑菌活性乳酸菌的篩選及其生理特性分析

任士菊，王俊鋼，周 紅，鄧 梅，馬 媛，倪永清，*（.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子83000；.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子83000）

冷水魚(yú)腸道抑菌活性乳酸菌的篩選及其生理特性分析

任士菊1，王俊鋼2，周 紅1，鄧 梅1，馬 媛1，倪永清1，*
（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆石河子832000）

利用牛津杯法對(duì)分離自冷水魚(yú)腸道的24株乳酸菌進(jìn)行篩選，得到具有明顯抑菌活性的乳酸菌9株，基于菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，6株屬于Lactococcus屬，3株屬于Enterococcus屬。對(duì)9株乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌成分分析和蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，9株乳酸菌的發(fā)酵上清液經(jīng)排除酸和過(guò)氧化氫干擾后，對(duì)李斯特菌仍具有不同程度的抑制作用；有機(jī)酸的產(chǎn)生對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株MHY3-2和MD-2抑菌活性的干擾影響較大，而菌株MB2-1和MD-1受有機(jī)酸干擾影響較小，且經(jīng)排除酸和過(guò)氧化氫后的乳酸菌對(duì)李斯特菌的抑菌效果最為顯著；分析發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)除菌株MB2-2和MD-1對(duì)胰蛋白酶表現(xiàn)不敏感外，其余實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶處理后均失去抑菌活性，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株的發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)，抑菌組分中可能存在類細(xì)菌素或細(xì)菌素組分。此外，對(duì)9株乳酸菌的抗生素耐藥性進(jìn)行初步分析，結(jié)果顯示，所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氨芐西林、萬(wàn)古霉素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)敏感，為冷水魚(yú)腸道乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

抑菌活性，乳酸菌，篩選，生理特性

大多數(shù)乳酸菌作為一般公認(rèn)的安全的（generally recognized as safe，GRAS）[1-3]微生物，被普遍應(yīng)用于食品保藏技術(shù)中，在一定程度上可以延長(zhǎng)食品貨架期，起到一定防腐的作用。乳酸菌在代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、雙乙酰以及細(xì)菌素等抑菌成分物質(zhì)[4-5]，能有效地抑制食品中一些食源性病原菌或腐敗菌的生長(zhǎng)[6-8]。細(xì)菌素作為一種安全的、天然的生物型防腐劑[9]取代化學(xué)合成的食品添加劑應(yīng)用到食品工業(yè)具有極大的應(yīng)用潛能[10]。雖然目前已知的細(xì)菌素種類繁多，但廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)且成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)的僅有乳酸鏈球菌素Nisin[11]。

乳酸菌在自然界中分布廣泛，低溫或極端環(huán)境中也發(fā)現(xiàn)有乳酸菌的存在，但是該類乳酸菌卻并未得到充分的認(rèn)識(shí)和開(kāi)發(fā)，尤其在國(guó)內(nèi)關(guān)于低溫乳酸菌尤其是具有抑菌活性的耐冷乳酸菌的研究和報(bào)道為空白。具有很強(qiáng)生長(zhǎng)活性和較高比生長(zhǎng)速率的產(chǎn)細(xì)菌素的適低溫乳酸菌，作為生物保護(hù)劑在食品保鮮尤其是低溫冷藏保鮮中具有更大的優(yōu)勢(shì)和極具潛力的應(yīng)用價(jià)值。

我國(guó)新疆北部阿勒泰地區(qū)地處北緯44°59′35″～49°10′45″之間，境內(nèi)額爾齊斯河、烏倫古河等流域蘊(yùn)藏著豐富的冷水魚(yú)資源，為研究和開(kāi)發(fā)具有抑菌活性的低溫乳酸菌提供了有利的條件。本研究從新疆冷水魚(yú)腸道分離的24株乳球菌（Lacterococcus spp.）、腸球菌（Enterococcus spp.）中篩選具有抑菌活性的乳酸菌菌株，并對(duì)抑菌活性乳酸菌發(fā)酵上清液的抑菌物質(zhì)成分及菌株的生理特性進(jìn)行了初步研究，為冷水魚(yú)腸道乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

24株乳酸菌 實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，分離自新疆阿勒泰地區(qū)額爾齊斯河流域冷水魚(yú)腸道；大腸桿菌、李斯特菌 實(shí)驗(yàn)室保藏菌株；金黃色葡萄球菌CICC21600 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心購(gòu)買(mǎi)；MRS肉湯、M17瓊脂 青島高科園海博生物技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR反應(yīng)試劑 生工生物工程（上海）有限公司；0.22μm微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；抗菌藥物紙片 杭州天和微生物試劑有限公司。

5810R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)eppendorf儀器公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱 寧波市江南儀器廠；PHS-3C標(biāo)準(zhǔn)型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；TC-512PCR擴(kuò)增儀 英國(guó)Techne公司；PowerPac Universal水平電泳儀 美國(guó)BioRad公司；UVmini-1240紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液的制備[12-13]分離自冷水魚(yú)腸道的24株乳酸菌，按2%的接種量接種于100mL MRS液體培養(yǎng)基中，16℃條件下培養(yǎng)48～72h后，離心（10000×g，10min，4℃）獲得上清液，并用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾得到無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液，于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 具有抑菌活性乳酸菌的初步篩選 選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯法[14]對(duì)24株乳酸菌進(jìn)行抑菌活性的初步篩選。取100μL指示菌菌懸液（濃度約為106～107CFU/mL）均勻涂布于LB平板，向牛津杯中加入200μL發(fā)酵上清液，4℃條件下預(yù)擴(kuò)散3～5h，37℃培養(yǎng)18～24h，測(cè)定抑菌圈直徑。

1.2.3 乳酸菌發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)成分分析 選取李斯特菌作為指示菌，采用牛津杯法對(duì)9株乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌成分分析。無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液通過(guò)以下幾種方式進(jìn)行處理：用1mol/L無(wú)菌NaOH調(diào)節(jié)上清液pH至6.5（圖1B）；先調(diào)節(jié)上清液pH至6.5，再加入過(guò)氧化氫酶（終濃度5mg/L）37℃水浴2h，進(jìn)行滅酶處理（圖1C）；為進(jìn)一步確定檢測(cè)抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，向上清液中分別加入胰蛋白酶和胃蛋白酶（終濃度1mg/mL）37℃水浴2h，進(jìn)行滅酶處理（見(jiàn)表2），以不做任何處理的發(fā)酵上清液作為對(duì)照（圖1A）。吸取200μL上述處理后的發(fā)酵上清液加于牛津杯中，4℃冰箱中預(yù)擴(kuò)散3～5h，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)量抑菌圈直徑，平行測(cè)定三次取平均值。

1.2.4 具有抑菌活性乳酸菌的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育分析 DNA的提取按照Z(yǔ)eng[15]等的方法進(jìn)行。采用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）擴(kuò)增乳酸菌16S rDNA基因。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%（w/v）瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。PCR產(chǎn)物送交上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST工具搜索同源性較高的序列，并采用CLUSTAL X 1.81和MEGA 5.0軟件對(duì)其進(jìn)行比對(duì)分析并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響 具有抑菌活性的乳酸菌菌株以2%接種量接種于10mL的MRS液體培養(yǎng)基中，分別置于4、12、16、24、28、37℃六個(gè)溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，24h后測(cè)定其OD600值。

1.2.6 藥物敏感性測(cè)定 采用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法[16]，測(cè)定9種具有抑菌活性的乳酸菌對(duì)常見(jiàn)15種抗生素的敏感性。吸取100μL菌懸液（濃度為107～108CFU/mL）均勻涂布于M17[17]固體平板表面，待瓊脂表面干燥后，將抗菌藥物紙片貼于瓊脂表面，每個(gè)培養(yǎng)皿等間距放置3張同種藥物的紙片，置于16℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24～48h，觀察并測(cè)定其抑菌圈直徑。9株乳酸菌藥敏實(shí)驗(yàn)的測(cè)定，選用金黃色葡萄球菌ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌，實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照WHO提供的最新版的NCCLS標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌活性乳酸菌的篩選

采用牛津杯法對(duì)分離自冷水魚(yú)腸道的24株乳酸菌進(jìn)行初步篩選，共得到具有明顯抑菌活性的菌株9株。由表1可以看出，9株乳酸菌對(duì)李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌3種指示菌均具有較好的抑制作用。

2.2 乳酸菌發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)成分分析

乳酸菌發(fā)酵上清液排除有機(jī)酸后，發(fā)現(xiàn)9種乳酸菌的發(fā)酵上清液對(duì)李斯特菌的抑制作用均有不同程度的減弱（見(jiàn)圖1）。這一現(xiàn)象的產(chǎn)生顯然是由于解除了乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸對(duì)指示細(xì)菌的抑菌作用[18]。由圖1可以看出，有機(jī)酸產(chǎn)生對(duì)菌株MHY3-2和MD-2抑菌活性干擾影響最顯著；而菌株MB2-1和MD-1的發(fā)酵上清液經(jīng)排除酸和過(guò)氧化氫處理后，對(duì)李斯特菌仍具有較好的抑菌效果，排酸實(shí)驗(yàn)對(duì)抑菌活性的干擾較小。而對(duì)比發(fā)酵上清液過(guò)氧化氫酶處理前后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1）可以看出，過(guò)氧化氫對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株發(fā)酵上清液抑菌活性的影響不明顯。

表1 具有抑菌活性乳酸菌的初篩結(jié)果（mm）Table 1 Preliminary result of lactic acid bacteria with inhibitory activity（mm）

圖1 無(wú)細(xì)胞發(fā)酵上清液抑菌物質(zhì)成分分析Fig.1 Antibacterial substance component analysis of cell-free fermentation supernatant

分析發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，9株乳酸菌發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)胃蛋白酶處理后，均失去抑菌活性；除菌株MB2-2和MD-1經(jīng)胰蛋白酶處理后抑菌圈直徑未發(fā)生明顯變化外，其余菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶均較敏感。上述結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)菌株的發(fā)酵上清液中的抑菌物質(zhì)具有蛋白質(zhì)的性質(zhì)，抑菌組分中可能存在類細(xì)菌素或細(xì)菌素組分。

2.3 抑菌活性乳酸菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育

基于9株乳酸菌16S rRNA部分基因序列，使用Maximum Likelihood構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示，具有抑菌活性的9株乳酸菌菌株分別屬于Lactococcus和Enterococcus屬。由系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，這些菌株隸屬于Lactococcus屬的6株，其中菌株MB2-2，MHY3-4和MB2-3與Lactococcus garvieae親緣關(guān)系較近；MD-1與菌株Lactococcuslactis subsp.lactis NFL（KC146069.1）具有99%的序列相似性，MHY3-2與Lactococcuspiscium MARL41（JN226415.1）的序列相似性在99%以上，而MHY3-3在發(fā)育樹(shù)上與Lactococcusraffinolactis cG08（AB593336.1）的親緣關(guān)系最近。菌株MB2-1，MD-2和MD-3隸屬于Enterococcus屬，其中菌株MD-2和MD-3在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上與Enterococcus faecalis LRC31（JF772057.1）聚為一簇，具有較近的進(jìn)化距離；MB2-1與Enterococcushermanniensis SS1760（GQ337028.1）的16S rDNA序列具有98%的同源性。

圖2 基于抑菌活性乳酸菌16SrRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenic tree of lactic acid bacteria with inhibitory activity based on 16S rRNA gene partial sequences

2.4 乳酸菌最適生長(zhǎng)溫度范圍的測(cè)定

由圖3可以看出，實(shí)驗(yàn)菌株在低于10℃條件下生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，15～20℃的條件下隨著溫度的升高，菌液的OD值呈上升趨勢(shì)。結(jié)果表明，乳酸菌的優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)溫度都在20℃以上，最適生長(zhǎng)溫度在24℃左右，生長(zhǎng)溫度范圍介于4～37℃，屬于耐冷乳酸菌范疇。

2.5 抗生素耐藥性分析

對(duì)9株具有抑菌活性的乳酸菌進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果（表3）顯示，所有實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)氨芐西林、萬(wàn)古霉素、紅霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)敏感，而對(duì)頭孢噻肟、克林霉素、卡那霉素和鏈霉素均耐藥。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)利福平、復(fù)方新諾明、青霉素及四環(huán)素表現(xiàn)敏感或中度敏感，而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)對(duì)慶大霉素表現(xiàn)耐藥。

表2 發(fā)酵上清液中抑菌物質(zhì)的蛋白質(zhì)性質(zhì)（mm）Table 2 Proteinaceous nature of fermentation supernatant inhibitory substance（mm）

圖3 溫度對(duì)9株抑菌活性乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of temperature on growth of 9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity

表3 9株具有抑菌活性的乳酸菌對(duì)抗生素的耐藥性Table 3 Antibiotic resistance of 9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity

3 結(jié)論

選取李斯特菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為指示菌，利用牛津杯法對(duì)分離自冷水魚(yú)腸道的24株乳酸菌進(jìn)行初步篩選，共篩選出具有明顯抑菌活性的乳酸菌9株，其中6株隸屬于Lactococcus屬，其他3株屬于Enterococcus屬。對(duì)9株乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌成分分析和蛋白酶敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，9株乳酸菌發(fā)酵上清液中可能存在細(xì)菌素或其他抑菌肽成分，這與G Rajaram等[4]報(bào)道的乳酸菌產(chǎn)生具有抑菌活性的蛋白或多肽的結(jié)論相一致。

研究發(fā)現(xiàn)，菌株MB2-1和MD-1排除酸和過(guò)氧化氫處理后的發(fā)酵上清液對(duì)李斯特菌的抑制效果最為突出，經(jīng)初步分析，這兩株乳酸菌可能為產(chǎn)細(xì)菌素或類細(xì)菌素的優(yōu)良菌株。

采用藥物紙片瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分屬于2個(gè)屬的9株乳酸菌進(jìn)行15種抗生素的敏感性測(cè)定，結(jié)果表明，所有菌株對(duì)氨芐西林，萬(wàn)古霉素，紅霉素，氯霉素，環(huán)丙沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)敏感，但對(duì)于其他抗生素，不同菌株存在不同程度的耐藥性，這可能與菌株是否攜帶耐藥基因及其生物學(xué)等特性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，許多腸球菌屬菌株存在gelE，esp，ace，efaA，vanA和vanB等毒力基因[19-21]，鑒于菌株MB2-1，MD-2和MD-3的安全性，后續(xù)我們將會(huì)對(duì)具有抑菌活性的腸球菌屬菌株的毒力基因及其產(chǎn)細(xì)菌素的相關(guān)特性進(jìn)行深入研究，為今后將其應(yīng)用于生物防腐技術(shù)及食品保鮮奠定理論基礎(chǔ)。

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Screening of lactic acid bacteria with inhibitory activity isolated from intestinal of cold water fish and analysis of its physiological property

REN Shi-ju1，WANG Jun-gang2，ZHOU Hong1，DENG Mei1，MA Yuan1，NI Yong-qing1，*
（1.College of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China；2.Agricultural Product Processing Research Institute，Xinjiang Academy of Agriculture，Shihezi 832000，China）

9 strains of lactic acid bacteria with inhibitory activity were screened from 24 lactic acid bacteria isolated from cold water fish intestinal by using oxford cup method.6 strains belonged to Lacterococcus genus and 3 strains belonged to Enterococcus genus by phylogenic analysis based on their partial 16S rDNA gene sequences.Cell-free fermenting supematants（CFSs）from 9 strains were performed to determine the inhibitory compounds and the proteninaceous nature of inhibitors.The result showed that CFSs of 9 lactic acid bacteria still exhibit different degree of inhibitory activity against Listeria monocytogenes after eliminating the effect of organic acid and hydrogen peroxide；the inhibitory activity of strains MHY3-2 and MD-2 were strongly dependent on the organic acid，whereas the influence of organic acid produced by strains MB2-1 and MD-1 on the inhibitory activity were negligible.CFSs of strains MB2-1 and MD-1 after eliminating organic acid and hydrogen peroxide show significant antibacterial activity against Listeria monocytogenes among 9 strains.The activity of all tested strains was lost by treating with pepsin and trysin but strains MB2-2 and MD-1 not sensitive to trypsin.The results demonstrated that the inhibitory compound was proteinaceous in nature and likely is bacterion-like or bacterion.In addition，antibiotic resistance of 9 strains of lactic acid bacteria was preliminarily tested.9 strains were sensitive to ampicillin，vancomycin，erythromycin，chloramphenicol，ciprofloxacin and norfloxacin.The safety aspects of strains with inhibitory activity studied could provid basis for exploitarion and application of lactic acid bacteria isolated from the intestine of cold water fish.

inhibitory activity；lactic acid bacteria；screening；physiological property

TS201.3

A

1002-0306（2014）14-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.031

2013－10－28 *通訊聯(lián)系人

任士菊（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31360001）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)博士資金專項(xiàng)（2011BB009）；石河子大學(xué)自然科學(xué)重點(diǎn)學(xué)科（ZRKX20104001）。