脈沖強(qiáng)光對(duì)糙米發(fā)芽過程中內(nèi)源酶活性的影響

王 勃，惠麗娟，劉 賀，何余堂，蔣 靜，劉 昕，馬 濤（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013）

脈沖強(qiáng)光對(duì)糙米發(fā)芽過程中內(nèi)源酶活性的影響

王 勃，惠麗娟，劉 賀，何余堂，蔣 靜，劉 昕，馬 濤*
（渤海大學(xué)化學(xué)化工與食品安全學(xué)院，渤海大學(xué)糧油科學(xué)與技術(shù)研究所，遼寧錦州121013）

研究了脈沖強(qiáng)光（IPL）不同單次能量、閃照次數(shù)、開始處理時(shí)間對(duì)糙米發(fā)芽過程中α-淀粉酶、蛋白酶及谷氨酸脫羧酶（GAD）的影響。結(jié)果表明，糙米浸泡后，在單次閃照能量400J，閃照次數(shù)300次，發(fā)芽25h時(shí)，α-淀粉酶活力達(dá)到12.38mg（g·min）-1、蛋白酶活力達(dá)到102.36mg（g·min）-1、谷氨酸脫羧酶（GAD）活力達(dá)到10.83mg（g·min）-1最高值分別為無處理組的2.87、1.30、2.16倍；高強(qiáng)度的脈沖強(qiáng)光處理，會(huì)抑制發(fā)芽糙米內(nèi)源酶活性。糙米浸泡后進(jìn)行適宜的脈沖強(qiáng)光處理，可以提高其內(nèi)源酶的活性。

脈沖強(qiáng)光，發(fā)芽糙米，內(nèi)源酶活性

糙米發(fā)芽是一個(gè)復(fù)雜的生理生化變化過程，是內(nèi)源酶被激活和釋放的過程，其生化路徑和產(chǎn)物形成容易受外界環(huán)境變化而改變[1]。糙米發(fā)芽初期主要的水解酶是α-淀粉酶，胚乳中的淀粉被α-淀粉酶轉(zhuǎn)化為可代謝的糖，為糙米的根芽生長(zhǎng)提供能量。糙米發(fā)芽過程中，貯藏的蛋白物質(zhì)在蛋白酶的作用下分解為多肽及氨基酸，為糙米生長(zhǎng)提供氮源，并且在復(fù)雜生理生化反應(yīng)中轉(zhuǎn)化為種子萌發(fā)和生長(zhǎng)所需的物質(zhì)。植物中谷氨酸脫羧酶的活性與植物衰老、種子發(fā)育和成熟有關(guān)。糙米發(fā)芽過程中產(chǎn)生的功能因子γ-氨基丁酸（GABA）的含量與GAD的活性有直接關(guān)系。在相關(guān)酶的作用下，糙米體內(nèi)蛋白質(zhì)分解、氨基酸代謝轉(zhuǎn)化生成L-谷氨酸，L-谷氨酸在磷酸吡哆醛等輔酶的作用下，經(jīng)GAD催化脫羧生成GABA。由于GAD使谷氨酸脫羧產(chǎn)生GABA，因而研究GAD活性對(duì)于功能食品的開發(fā)意義重大。

研究表明，脈沖強(qiáng)光技術(shù)在一定處理?xiàng)l件下可以促進(jìn)糙米發(fā)芽。本文通過研究糙米發(fā)芽過程內(nèi)源酶活性變化與脈沖強(qiáng)光處理?xiàng)l件的相互關(guān)系，為通過控制GAD活性變化提高糙米發(fā)芽GABA的含量及揭示其機(jī)理提供依據(jù)[2-3]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻米品種“遼星1號(hào)” 由中稻股份有限公司提供，實(shí)驗(yàn)前用礱谷機(jī)去除稻谷外殼獲得糙米；GABA標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）、酪蛋白 Sigma公司；次氯酸鈉（有效氯為9%） 廣東汕頭市西隴化工廠；重蒸苯酚（AR） 武漢天源生物技術(shù)有限公司；氯化鈉、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、（NH4）2SO4、可溶性淀粉、苯甲基磺酰氟 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸吡哆醛、乙二胺四乙酸 南京賽吉生化試劑公司；β-巰基乙醇、酪氨酸、牛血清蛋白 上海申鶴化學(xué)有限公司。

LA50-800H脈沖強(qiáng)光表面殺菌實(shí)驗(yàn)柜 寧波中物光電殺菌技術(shù)有限公司；電子天平BT1245 北京賽多利斯儀器有限公司；HH.B11-500電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；HH-601A超級(jí)恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；UV1200型紫外可見分光光度計(jì) 上海正慧工貿(mào)有限公司；PB-20標(biāo)準(zhǔn)pH計(jì) 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)芽糙米的制備 工藝流程：稻谷→礱谷→篩選→手工精選→清洗→殺菌→清洗→浸泡→發(fā)芽→清洗→干燥→成品[4]。

將精選的糙米30℃條件下浸泡12h，然后進(jìn)行發(fā)芽糙米的培養(yǎng)，期間進(jìn)行相應(yīng)脈沖強(qiáng)光照射處理。為抑制糙米發(fā)芽過程中微生物的污染，將糙米用1.0%的次氯酸鈉溶液浸泡5min，蒸餾水沖洗3遍后，加入4倍體積的水，然后放入恒溫水浴鍋中浸泡。糙米浸泡后用蒸餾水清洗，均勻地?cái)傆诘撞夸佊兴膶蛹啿嫉呐囵B(yǎng)皿中，然后蓋上兩層濕潤(rùn)紗布，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)25h發(fā)芽。發(fā)芽過程每隔2h噴灑去離子水，以保證整個(gè)發(fā)芽過程的濕潤(rùn)狀態(tài)。

1.2.2 脈沖強(qiáng)光參數(shù)設(shè)置與實(shí)驗(yàn)方法 脈沖強(qiáng)光裝置：工作電壓2800V，額定功率1kW，電源：AC220± 10%，內(nèi)置石英板調(diào)節(jié)照射距離，共有六個(gè)高度可以調(diào)節(jié)。樣品輻照室規(guī)格：480mm（寬）×400mm（高）× 270mm（深）。處理樣品置于燈管正下方石英板上[5-9]。

在糙米發(fā)芽培養(yǎng)不同時(shí)間，將單層糙米（均勻鋪滿培養(yǎng)皿，一般8g/皿），在不同單次能量（300、400、500J）和不同閃照次數(shù)（100、200、300、400、500次）下閃照處理，閃照頻次為1次/s，處理后，繼續(xù)培養(yǎng)糙米發(fā)芽。處理期間，適當(dāng)翻動(dòng)糙米，使其照射均勻。培養(yǎng)25h后，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定[10-11]。

1.3 α-淀粉酶活力的測(cè)定方法

1.3.1 酶液的提取 稱取2.00g發(fā)芽糙米，加入低溫貯藏的pH5.7磷酸緩沖液5mL，勻漿后加入蒸餾水10mL提取，提取液冷凍離心15min，上清液即為淀粉酶提取液。將酶粗提液在70℃加熱15min，除去不耐熱的β-淀粉酶及其他酶蛋白，而后加入（NH4）2SO4固體進(jìn)行鹽析，4000r/min離心10min，沉淀中加入一定體積的磷酸緩沖液（pH5.7），使其溶解，取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定[12]。

1.3.2 酶活的測(cè)定 參考朱廣廉[13]測(cè)定方法，酶活測(cè)定時(shí)，試管先加入2mL的磷酸緩沖液和0.5mL 1%可溶性淀粉溶液，酶液及試管均在40℃條件預(yù)保溫10min，之后將0.5mL酶液加入試管中，準(zhǔn)確反應(yīng)5min，加入6mol/L NaOH 1mL終止反應(yīng)，加入2mL DNS試劑并搖勻，沸水浴5min，流水冷卻，用水稀釋至25mL。將試管搖勻，顯色后測(cè)定吸光度。通過葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=1.550X+0.0292（Y為葡萄糖的濃度，mg/mL；X為A540，R2=0.999）計(jì)算α-淀粉酶產(chǎn)生的葡萄糖含量。

1.4 蛋白酶活力測(cè)定方法

1.4.1 酶液的提取 稱取2.00g發(fā)芽糙米，于研缽中加入8mL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖（pH6.0，0.1mol/L），冰浴下研磨成勻漿。之后在4℃下10000r/min離心30min，取上清液進(jìn)行酶活力測(cè)定。

1.4.2 酶活的測(cè)定 參考Harvey BMR[14]測(cè)定方法，以酪蛋白溶液（20g/L）為底物，1mL的底物溶液和1mL的酶提取液在40℃下保溫10min，之后90℃水浴保溫5min滅酶，然后加入2mL TCA（0.4mol/L）溶液于室溫下沉淀未反應(yīng)的蛋白質(zhì)15min。蛋白酶活力通過測(cè)定在275nm處吸光值的增加量計(jì)算，對(duì)照管與上述所加組分相同，但在進(jìn)行反應(yīng)前先加入TCA溶液滅酶。以酪氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定中1g發(fā)芽糙米的酶提取液每分鐘產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1U的蛋白酶活力。

1.5 谷氨酸脫羧酶活性的測(cè)定

1.5.1 酶液的提取 取5.00g發(fā)芽糙米用提取緩沖液[50mmol/L磷酸緩沖液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），2mmol/L EDTA，0.2%β-巰基乙醇，0.15mmol/L氯化鈉]研磨勻漿定容到50mL，靜止提取2h后于4000r/min離心10min，取上清液進(jìn)行酶活測(cè)定[15]。

1.5.2 酶活的測(cè)定 取0.3mL粗酶液加入0.2mL的底物反應(yīng)液[含50mmol/L磷酸緩沖液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛，100mmol/L L-谷氨酸]，于30℃水浴保溫30～180min后迅速置于冰浴中終止反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)生的GABA含量，以1g發(fā)芽糙米酶提取液每分鐘催化L-谷氨酸脫羧生成1μg GABA為一個(gè)酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與分析

2.1 脈沖強(qiáng)光處理對(duì)糙米α-淀粉酶活性的影響

2.1.1 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響 將精選的糙米分別在浸泡前、浸泡后、發(fā)芽12h時(shí)，采用不同單次能量（300、400、500J）的脈沖強(qiáng)光閃照300次處理。發(fā)芽25h后，α-淀粉酶活性見圖1。

圖1 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響Fig.1 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on α-amylase activity

由圖1可以看出，在不同工序點(diǎn)對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光閃照處理，對(duì)α-淀粉酶活性影響不同。浸泡前對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，對(duì)糙米α-淀粉酶活性影響不大；浸泡后對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理能顯著提高酶活性；發(fā)芽12h時(shí)處理酶活提高程度沒有浸泡后好。因此，選擇浸泡后實(shí)施脈沖強(qiáng)光處理最佳。

2.1.2 脈沖強(qiáng)光不同單次能量對(duì)α-淀粉酶活變化的影響 糙米浸泡后進(jìn)行相應(yīng)的脈沖強(qiáng)光處理，測(cè)定不同時(shí)段α-淀粉酶活的變化，不同單次能量α-淀粉酶活性的變化規(guī)律如圖2～圖4所示。

圖2 單次能量300J閃照處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響Fig.2 Effect of single energy 300J on α-amylase activity

單次能量300J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，α-淀粉酶活性均呈上升趨勢(shì)，且最終酶活均高于對(duì)照組。閃照300次時(shí)，α-淀粉酶活性在發(fā)芽10h時(shí)之前低于400次和500次，但在10～15h時(shí)，酶活呈明顯升高趨勢(shì)，隨后在15～25h時(shí)酶活均高于其他閃照次數(shù)，并在25h時(shí)達(dá)到最高的11.39mg（g·min）-1。說明在300次條件處理下，糙米中α-淀粉酶活性有一個(gè)促發(fā)點(diǎn)，能使酶活顯著提高。

圖3 單次能量400J閃照處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響Fig.3 Effect of single energy 400J on α-amylase activity

單次能量400J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，α-淀粉酶活性均呈上升趨勢(shì)，且最終酶活均高于對(duì)照組。閃照100、200、300次處理，α-淀粉酶活變化呈上升趨勢(shì)，閃照400、500次處理，α-淀粉酶活力并沒有繼續(xù)上高，反而低于200次處理，說明增加閃照次數(shù)并不能持續(xù)提高酶活力，反而有可能抑制酶活力；在單次能量400J，閃照次數(shù)300次條件處理下，α-淀粉酶活力在發(fā)芽25h時(shí)達(dá)到了最大的12.38mg（g·min）-1，是無處理組4.32mg（g·min）-1的2.87倍。

單次能量500J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，α-淀粉酶活性均呈上升趨勢(shì)，在200次，發(fā)芽25h時(shí)α-淀粉酶活力達(dá)到最高的10.96mg（g·min）-1，但最高酶活力均低于300J和400J，說明增加單次閃照能量不能持續(xù)提高α-淀粉酶活力。在發(fā)芽時(shí)間10～15h時(shí)，酶活力變化很小，15h之后酶活力才有明顯升高。說明高能量多次數(shù)的脈沖閃照處理會(huì)延遲α-淀粉酶活的提高，并影響最終α-淀粉酶活。

圖4 單次能量500J閃照處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響Fig.4 Effect of single energy 500J on α-amylase activity

2.2 脈沖強(qiáng)光處理對(duì)發(fā)芽糙米蛋白酶活性的影響

2.2.1 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)蛋白酶的影響 將精選的糙米分別在浸泡前、浸泡后、發(fā)芽12h時(shí)，采用不同單次能量（300、400、500J）的脈沖強(qiáng)光閃照300次處理。發(fā)芽25h后，蛋白酶活性見圖5。

圖5 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)蛋白酶的影響Fig.5 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on protease activity

由圖5可以看出，浸泡前對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，對(duì)糙米蛋白酶活性影響不大；浸泡后對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理，300、400J時(shí)蛋白酶活力呈上升趨勢(shì)，在500J時(shí)蛋白酶活力有所下降，高強(qiáng)度脈沖強(qiáng)光會(huì)抑制糙米發(fā)芽過程中蛋白酶活性；發(fā)芽12h時(shí)，采用脈沖強(qiáng)光處理處理，在300J時(shí)略高于未處理組，400、500J時(shí)酶活力均低于未處理組，發(fā)芽12h后，糙米發(fā)芽過程中蛋白酶活性已經(jīng)被激活，此時(shí)進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理對(duì)蛋白酶活力有抑制作用。因此，選擇浸泡后實(shí)施脈沖強(qiáng)光處理最佳。

2.2.2 脈沖強(qiáng)光不同單次能量對(duì)蛋白酶活變化的影響 糙米浸泡后進(jìn)行相應(yīng)的脈沖強(qiáng)光處理，測(cè)定不同時(shí)段蛋白酶活的變化，“CK”為對(duì)照組，不同單次能量蛋白酶活性的變化規(guī)律如圖6～圖8所示。

圖6 單次能量300J閃照處理對(duì)蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of flash number 300J on protease activity

單次能量300J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，蛋白酶活性均呈上升趨勢(shì)，且最終酶活均高于對(duì)照組。不同閃照次數(shù)對(duì)酶活變化趨勢(shì)影響相似，均是在15～25h酶活顯著增高。閃照300次，在發(fā)芽25h時(shí)，蛋白酶活力最高。

圖7 單次能量400J閃照處理對(duì)蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of flash number 400J on protease activity

單次能量400J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，蛋白酶活性均呈上升趨勢(shì)，且變化趨勢(shì)大致相同。閃照300次處理時(shí)，蛋白酶活最高；閃照500次處理時(shí)，蛋白酶活最低且低于對(duì)照組。

圖8 單次能量500J閃照處理對(duì)α-淀粉酶活性的影響Fig.8 Effect of flash number 500J on protease activity

單次能量500J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，蛋白酶活性均呈上升趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，閃照400、500次時(shí)，蛋白酶最終酶活低于對(duì)照組。說明高能量高次數(shù)的脈沖閃照處理會(huì)抑制發(fā)芽糙米蛋白酶活性。

2.3 脈沖強(qiáng)光處理對(duì)發(fā)芽糙米谷氨酸脫羧酶（GAD）活性的影響

2.3.1 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)谷氨酸脫羧酶的影響 將精選的糙米分別在浸泡前、浸泡后、發(fā)芽12h時(shí)，采用不同單次能量（300、400、500J）的脈沖強(qiáng)光閃照300次處理。發(fā)芽25h后，谷氨酸脫羧酶活性見圖9。

圖9 脈沖強(qiáng)光不同能量在工藝流程不同工序點(diǎn)處理對(duì)谷氨酸脫羧酶的影響Fig.9 Pulsed light of different energy in different process procedures treatment effect on glutamic acid decarboxylase（GAD）activity

由圖9可以看出，不同時(shí)間對(duì)糙米進(jìn)行脈沖強(qiáng)光閃照處理，均能提高GAD活性，但影響程度不同，影響程度依次為浸泡后＞發(fā)芽12h＞浸泡前。因此，選擇浸泡后實(shí)施脈沖強(qiáng)光處理最佳。

2.3.2 脈沖強(qiáng)光不同單次能量對(duì)谷氨酸脫羧酶活變化的影響 糙米浸泡后進(jìn)行相應(yīng)的脈沖強(qiáng)光處理，測(cè)定不同時(shí)段谷氨酸脫羧酶活的變化，“CK”為對(duì)照組，不同單次能量谷氨酸脫羧酶活性的變化規(guī)律如圖10～圖12所示。

圖10 單次能量300J閃照處理對(duì)谷氨酸脫羧酶活性的影響Fig.10 Effect of single energy 300J on GAD activity

單次能量300J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，GAD活性均呈上升趨勢(shì)，且最終酶活均高于對(duì)照組。不同閃照次數(shù)對(duì)GAD活性變化趨勢(shì)影響相似，均是在10h后開始顯著增高。閃照300次，GAD活性最高。

單次能量400J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，GAD活性均呈上升趨勢(shì)。閃照300次處理時(shí)，GAD活性最高，酶活變化呈直線上升；閃照500次處理時(shí)，GAD受到抑制。

單次能量500J不同閃照次數(shù)處理?xiàng)l件下，隨著發(fā)芽過程的進(jìn)行，谷氨酸脫羧酶活性均呈上升趨勢(shì)，閃照500次處理，上升趨勢(shì)不明顯。與對(duì)照組相比，閃照400、500次時(shí)，谷氨酸脫羧酶最終酶活低于對(duì)照組。說明高能量高次數(shù)的脈沖閃照處理會(huì)降低發(fā)芽糙米GAD活性。

圖11 單次能量400J閃照處理對(duì)谷氨酸脫羧酶活性的影響Fig.11 Effect of single energy 400J on GAD activity

圖12 單次能量500J閃照處理對(duì)谷氨酸脫羧酶活性的影響Fig.12 Effect of single energy 500J on GAD activity

3 結(jié)論

3.1 單次能量高于300J，會(huì)抑制發(fā)芽糙米內(nèi)源酶活性。糙米浸泡后進(jìn)行適宜的脈沖強(qiáng)光處理，可以提高其內(nèi)源酶的活性。不同工序利用脈沖強(qiáng)光處理對(duì)發(fā)芽糙米酶活影響依次為：浸泡后＞發(fā)芽12h＞浸泡前。

3.2 對(duì)α-淀粉酶的影響：?jiǎn)未文芰?00J，閃照300次，發(fā)芽25h時(shí)，α-淀粉酶活力達(dá)到12.38mg（g·min）-1，酶活是無處理組的2.87倍。

3.3 對(duì)蛋白酶的影響：?jiǎn)未文芰?00J，閃照300次，發(fā)芽25h，蛋白酶活性達(dá)到最大值，蛋白酶活力達(dá)到102.36mg（g·min）-1，是無處理組1.3倍。

3.4 對(duì)谷氨酸脫羧酶的影響：?jiǎn)未文芰?00J，閃照300次，發(fā)芽25h，GAD活性達(dá)到最大值10.83mg（g·min）-1，是無處理組的2.16倍。

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Effect of pulsed light treatment on the endogenous enzyme activity of germinated brown rice

WANG Bo，HUI Li-juan，LIU He，HE Yu-tang，JIANG Jing，LIU Xin，MA Tao*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

The effects of pulsed light through different single energy，flash time and treatment start time on the activity of alpha-amylase，protease，and glutamic acid decarboxylase（GAD）during the brown rice germination was studied.The results showed that brown rice after soaking，single energy of 400J，flash time of 300，the germination of 25h，α-amylase activity reached 12.38mg（g·min）-1，protease activity reached 102.36mg（g·min）-1，glutamic acid decarboxylase（GAD）activity reached 10.83mg（g·min）-1，the maximum value were 2.87，1.30，2.16 times higher than non-treated group.High-intensity pulsed light treatment can inhibit endogenous enzyme activity of germinated brown rice.Suitable pulsed light for processing brown rice after soaking them can improve the endogenous enzyme activity.

pulsed light；germinated brown rice；endogenous enzyme activity

TS210.1

A

1002-0306（2014）14-0118-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.017

2013－10－23 *通訊聯(lián)系人

王勃（1986-），男，碩士研究生，研究方向：糧油科學(xué)。

科技部國(guó)家農(nóng)業(yè)成果轉(zhuǎn)化資金（2010GB2B000083）；遼寧省科技攻關(guān)課題（2011205001）。