槲皮素異戊烯基修飾及清除自由基活性研究

李 梅，董華強(qiáng)，陳鏈杰，張英慧（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品與園藝學(xué)院，廣東佛山528231）

槲皮素異戊烯基修飾及清除自由基活性研究

李 梅，董華強(qiáng)，陳鏈杰，張英慧
（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品與園藝學(xué)院，廣東佛山528231）

目的：對(duì)槲皮素分子進(jìn)行異戊烯化結(jié)構(gòu)修飾，探索槲皮素異戊烯基修飾的最佳條件以及修飾產(chǎn)物的抗氧化活性。方法：以槲皮素、溴代異戊烯基為原料，采用威廉姆遜成醚法合成槲皮素異戊烯基修飾物，采用鄰苯三酚自氧化法、DPPH法、Fenton反應(yīng)法檢測修飾產(chǎn)物體外對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH自由基、羥自由基的清除作用。結(jié)果：槲皮素異戊烯基修飾的最佳反應(yīng)條件為槲皮素與異戊烯基溴的比例為1∶1，在催化劑無水碳酸鉀的作用下，60℃水浴冷凝逆流反應(yīng)8h，經(jīng)柱層析分離獲得異戊烯基修飾物，HPLC檢測產(chǎn)物出峰時(shí)間較槲皮素晚，獲得的產(chǎn)物可能有兩種，峰面積為48.9%。槲皮素經(jīng)異戊烯基化修飾后，所得產(chǎn)物對(duì)羥自由基的清除率顯著增加；低濃度時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力也增強(qiáng)，但對(duì)DPPH自由基的清除率低于槲皮素。結(jié)論：對(duì)槲皮素進(jìn)行異戊烯基修飾，所得的異戊烯基修飾物是生物活性比槲皮素更高的新型活性化合物。

槲皮素，異戊烯化修飾，自由基，清除

自由基是人體正常代謝過程中的產(chǎn)物，具有高度的化學(xué)活性，可對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害，生命活動(dòng)的代謝過程中不斷產(chǎn)生各種氧自由基，是產(chǎn)生疾病的主要原因之一。從中草藥活性成分中尋找和開發(fā)具有較強(qiáng)清除自由基作用的低毒抗氧化劑已成為人們研究的熱點(diǎn)[1]。槲皮素（quercetin，3，3’，4’，5，7-五羥基黃酮，結(jié)構(gòu)見圖1）是含量最為豐富的黃酮類化合物之一，具有廣泛的抗腫瘤、抗血小板、抗氧化等藥理作用，但該化合物含有多個(gè)極性基團(tuán)羥基，親脂性弱，同時(shí)由于羥基在分子間形成氫鍵，晶格能較高，親水性也很差（槲皮素在水中溶解度為7μg/mL），導(dǎo)致其生物利用度低，大大限制了其臨床應(yīng)用[2-5]，因此，槲皮素及其衍生物的合成及生物活性研究越來越受到人們的關(guān)注。近年來，學(xué)者們利用槲皮素分子中的活性基團(tuán)——羥基，合成了一系列的槲皮素衍生物，期望改善槲皮素的藥物性能[6-9]。異戊烯黃酮類化合物是黃酮類化合物中獨(dú)特的一類。研究表明，異戊烯基的存在極大的增長了該類化合物的親脂性，使得化合物分子能夠強(qiáng)烈的親和生物膜，進(jìn)而可引起相關(guān)生物活性的顯著提高[10-11]。對(duì)槲皮素進(jìn)行異戊烯基修飾，可能會(huì)合成新的具有較高生物活性的物質(zhì)。

本研究擬對(duì)槲皮素分子進(jìn)行異戊烯化結(jié)構(gòu)修飾，并對(duì)槲皮素及其異戊烯基化修飾物的抗氧化能力進(jìn)行比較，為尋找新型、高效、低毒的槲皮素修飾物提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

槲皮素（95%）、異戊烯基溴（90%） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑 均為市售分析純。

2690高效液相色譜儀 美國Waters公司；722可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槲皮素異戊烯基修飾物的冷凝逆流合成 利用異戊烯基溴取代槲皮素中某一位置的H原子，從而發(fā)生直接異戊烯基化的取代反應(yīng)。合成路線如圖1所示[12]。

圖1 槲皮素異戊烯基修飾物合成路線圖Fig.1 Synthetic roadmap of quercetin isopentenyl modifier

按照以上路線圖，準(zhǔn)確稱量（0.302g，1mmol）的槲皮素，50mL丙酮溶解，加入少量無水碳酸鉀（催化劑），0℃冰浴條件下加入與槲皮素相應(yīng)摩爾比例（1∶1、1∶2、1∶3）的異戊烯溴丙酮溶液，振蕩均勻后，于58～62℃下冷凝逆流（密封、避光）4～16h，利用薄層層析法（TLC）跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。反應(yīng)完成后濾去碳酸鉀，用丙酮潤洗旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸干產(chǎn)物用乙醚/乙酸乙酯萃取，濃縮，經(jīng)柱層析分離（二氯甲烷∶乙酸乙酯=4∶1），得黃褐色固體，即槲皮素異戊烯基修飾物。用高效液相色譜法（色譜條件，色譜柱：C18（250nm×416nm，5滋m）反相液相色譜柱；流動(dòng)相：甲醇（色譜純）；流速：1mL/min；檢測波長：360nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：10滋L。檢測器：UV）測定峰值，對(duì)比底物槲皮素與反應(yīng)后的異戊烯基修飾產(chǎn)物的出峰時(shí)間和峰值差異。

1.2.2 槲皮素及其異戊烯基化修飾物抗氧化活性測定 以槲皮素為對(duì)照，研究不同濃度的槲皮素異戊烯基化修飾物對(duì)不同體系自由基的清除能力。

1.2.2.1 對(duì)羥自由基的清除作用 比色法測定Fenton反應(yīng)生成的羥自由基，在各試管中加入不同濃度的槲皮素、槲皮素異戊烯基修飾物0.5mL，再依次加入9mmol/L Fe2+溶液0.5mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5mL，最后加入9.1mmol/L H2O25mL啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后在510nm測量不同濃度下的吸光度為A1。取0.5mL蒸餾水取代9mmol/L Fe2+溶液測定吸光度為A2。取0.5mL蒸餾水代替不同濃度樣液測吸光度為A3。

1.2.2.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 采用鄰苯三酚自氧化法測定不同濃度的槲皮素、槲皮素異戊烯基修飾物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。于試管中加入相應(yīng)試劑，25℃恒溫預(yù)熱20min，取混合液3mL于比色皿中加入45mmol/L鄰苯三酚（用0.01mol/L HCl配成）0.1mL，搖勻反應(yīng)4min后在波長325nm處測定吸光度值，其中，A1為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL樣液+0.1mL 45mmol/L鄰苯三酚時(shí)的吸光度；A2為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL樣液時(shí)的吸光度；A3為9mL pH8磷酸鹽緩沖液+1mL蒸餾水+0.1mL 45mmol/L鄰苯三酚時(shí)的吸光度。

1.2.2.3 對(duì)DPPH自由基的清除作用 比色法測定槲皮素及其異戊烯基修飾物對(duì)DPPH·的清除作用：DPPH用95%乙醇配制0.0001mol/L溶液，于試管中加入相應(yīng)試劑，25℃恒溫預(yù)熱30min，在波長517nm下測定吸光度。其中，A1為5mL DPPH溶液+0.5mL樣液時(shí)的吸光度；A2為5mL 95%的乙醇+0.5mL樣液時(shí)的吸光度；A3為5mL DPPH溶液+0.5mL蒸餾水的吸光度。

1.2.2.4 自由基清除率P（%）的計(jì)算 以上各體系測定所得的吸光度為A1、A2和A3代入以下公式，計(jì)算不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對(duì)不同體系自由基的清除能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行整理，利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖2 反應(yīng)物槲皮素色譜圖Fig.2 Chromatogram of reactants quercetin

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素異戊烯基修飾物的合成

由于槲皮素分子中存在著五個(gè)羥基官能團(tuán)，即存在多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)，導(dǎo)致反應(yīng)的選擇性差，合成的產(chǎn)物可能是單取代反應(yīng)產(chǎn)物，也可能是多取代反應(yīng)產(chǎn)物，將槲皮素與異戊烯基溴按（1∶2，1∶3）的比例于58～62℃下冷凝逆流反應(yīng)4～16h后，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)薄層層析法監(jiān)測，斑點(diǎn)復(fù)雜，重現(xiàn)性差，意味著反應(yīng)選擇性差，副產(chǎn)物多，而兩者按1∶1的比例合成時(shí)，TLC監(jiān)測的斑點(diǎn)集中少數(shù)幾個(gè)點(diǎn)，且重現(xiàn)性較好，推測由于槲皮素分子結(jié)構(gòu)中有5個(gè)羥基酸性各不相同，反應(yīng)活性也不相同，在弱堿（K2CO3）存在條件下，可能是苷原上的酚羥基選擇性的連接異戊烯基，從而得到較高產(chǎn)率的單一或幾種衍生物。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，槲皮素與異戊烯基溴1∶1的比例，有催化劑無水碳酸鉀作用條件下，在60℃水浴下反應(yīng)8h后得槲皮素異戊烯基修飾產(chǎn)物的數(shù)量最多。該產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離，獲得純度較高的單取代異戊烯基修飾產(chǎn)物。

圖3 合成后產(chǎn)物色譜圖Fig.3 Chromatogram of synthetic product

由圖3可知，反應(yīng)產(chǎn)物主要有兩種物質(zhì)，保留時(shí)間分別為4.387min和4.782min，尤其是后一種產(chǎn)物的峰面積占48.9%。產(chǎn)物的保留時(shí)間比槲皮素的出峰時(shí)間1.877min晚2.51min和2.905min，可以得出：第一，保留時(shí)間不同，組分不同，兩種產(chǎn)物是不同于反應(yīng)物槲皮素的新物質(zhì)；第二，高效液相所用柱子為C18反相液相色譜柱，出峰時(shí)間越晚，極性越小，因此，可推測4.387min和4.782min出峰的新物質(zhì)極性比1.877min出峰的反應(yīng)物槲皮素極性小，符合產(chǎn)物特性。

2.2 槲皮素及其異戊烯基修飾物的抗氧化活性

2.2.1 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對(duì)羥自由基的清除能力 羥基自由基是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基，它可與活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損害，且反應(yīng)速度快，能殺死紅細(xì)胞，降解DNA、細(xì)胞膜和多糖化合物，許多由它所致的有害效應(yīng)在加入羥自由基的清除劑后會(huì)明顯降低，所以羥自由基清除率是評(píng)價(jià)物質(zhì)對(duì)自由基的清除效果的最常用的指標(biāo)之一。槲皮素是一種天然強(qiáng)氧化劑，大量研究表明，槲皮素的酯類衍生物和金屬配合物具有比槲皮素更強(qiáng)的抗氧化活性[13-14]。從圖4可知，槲皮素和異戊烯基修飾物都具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的活性，隨著濃度的增大，兩者清除羥基自由基的活性均急劇增加，呈一定的量效關(guān)系。槲皮素異戊烯基修飾物的清除活性明顯強(qiáng)于槲皮素，樣液濃度同為40μmol/L時(shí)，異戊烯基修飾物對(duì)羥自由基的清除率已經(jīng)達(dá)到87.41%，而槲皮素對(duì)羥自由基的清除率不足50%，說明對(duì)槲皮素進(jìn)行異戊烯基修飾后，其對(duì)羥自由基的清除能力會(huì)大大提高。

圖4 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對(duì)羥自由基的清除率Fig.4 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to·OH

2.2.2 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力 生物體內(nèi)氧化還原反應(yīng)中，大致有2%～5%的氧會(huì)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基的毒性是機(jī)體發(fā)生氧中毒的主要原因，表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用，進(jìn)而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失活、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化。

圖5 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對(duì)超氧陰離子的清除率Fig.5 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to O2-·

不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基修飾物對(duì)O2-·的清除率見圖5，槲皮素和槲皮素異戊烯基修飾物都具有較強(qiáng)的清除O2-·的作用，隨著濃度的增加，清除率也呈明顯上升趨勢，呈現(xiàn)量-效關(guān)系。在低濃度時(shí)（0.25～1.5μmol/L），槲皮素異戊烯基修飾物的清除率高于槲皮素（p＜0.05），在高濃度時(shí)（1.50～6.0μmol/L），槲皮素高于槲皮素異戊烯基修飾物（p＜0.05），這與對(duì)羥自由基的清除作用表現(xiàn)不同，槲皮素鉬配合物也有相似表現(xiàn)[15]，這可能是因?yàn)殚纹に丶伴纹に禺愇煜┗揎椢飳?duì)O2-·和·OH反應(yīng)的活性部位和作用機(jī)制存在差異，具體的機(jī)理尚需進(jìn)一步的研究。

圖6 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對(duì)DPPH·的清除率Fig.6 Scawenging activities of quercetin and quercetin prenylation modification to DPPH·

2.2.3 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對(duì)DPPH·的清除能力 DPPH·在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在517nm處對(duì)光有較強(qiáng)的吸收，當(dāng)有自由基消除劑存在時(shí)，其孤電子被配對(duì)，吸收消失或減弱。因此，可通過檢測自由基的清除情況，來評(píng)價(jià)某物質(zhì)的氧化能力。自由基清除率越大，物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖6），槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物均有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，且隨樣液濃度的增加而增加，相比，槲皮素對(duì)DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)，但兩者無顯著差異，槲皮素進(jìn)行異戊烯基修飾后，并不能增強(qiáng)其對(duì)DPPH自由基的清除活性。

2.3 槲皮素及其異戊烯基化修飾物對(duì)不同體系自由基清除率的比較

以清除自由基達(dá)到穩(wěn)定態(tài)50%清除率所需加入槲皮素或槲皮素異戊烯基修飾物的量為IC50（μmol/L），用以表示其抗氧化能力。IC50值越小，達(dá)到50%自由基清除率所需的抗氧化劑越少，表明其抗氧化能力越強(qiáng)。從表1可以看出，槲皮素對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力最強(qiáng)，其次是DPPH自由基，對(duì)羥自由基的清除能力最弱，經(jīng)異戊烯基修飾后，產(chǎn)物對(duì)羥自由基的IC50為15.27μmol/L，遠(yuǎn)小于槲皮素的39.53μmol/L，低濃度時(shí)，異戊烯基修飾物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力也較槲皮素更強(qiáng)，但對(duì)DPPH·的清除能力較槲皮素減弱，具體原因尚待進(jìn)一步的研究。

表1 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物體外清除自由基IC50（μmol/L）Table 1 Quercetin and quercetin isopentenyl modification to different free radicals scavenging IC50（μmol/L）

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)對(duì)槲皮素分子進(jìn)行異戊烯化結(jié)構(gòu)修飾，探索出槲皮素異戊烯基修飾產(chǎn)物的最佳條件：槲皮素反應(yīng)物與異戊烯基溴的比例為1∶1，在催化劑無水碳酸鉀的作用下，60℃水浴冷凝逆流反應(yīng)8h。經(jīng)柱層析分離可獲得純度較高，可能包含兩種成分的異戊烯基修飾物。

3.2 槲皮素具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行異戊烯基化修飾，所得的異戊烯基化修飾物的體外抗氧化活性會(huì)顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)為對(duì)羥自由基的清除率較槲皮素顯著增加；低濃度時(shí)對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力也較槲皮素強(qiáng)，但對(duì)DPPH自由基的清除率低于槲皮素。

3.3 對(duì)槲皮素進(jìn)行異戊烯基修飾，獲得的槲皮素異戊烯基修飾物可能是生物活性比槲皮素更高的新型活性化合物，具體合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其食用和藥用價(jià)值有待進(jìn)一步的研究。

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Study on quercetin isopentenyl modification and free radical scavenging activity

LI Mei，DONG Hua-qiang，CHEN Lian-jie，ZHANG Ying-hui
（College of Food and Horticulture，F(xiàn)oshan University，F(xiàn)oshan 528231，China）

Objective：The best conditions of synthesizing quercetin isopentenyl modifier and the antioxidant activity of modified products were discovered.Methods：The Williamson forming ether method was adopted to synthesizing quercetin isopentenyl modifier with quercetin and prenyl bromide as raw reactants.Moreover，the scavenging effects of modified products in vitro on superoxide anion（by pyrogallol autoxidation method），DPPH radical and hydroxyl radicals（by Fenton reaction method）were evaluated.Results：The optimal reaction conditions to synthesize quercetin modifier were quercetin and prenyl bromide ratio of 1∶1，the catalyst role of anhydrous potassium carbonate，60℃ water bath reflux condensation reaction 8h，separated by column chromatography to obtain modifications.HPLC retention times of the product detected later than quercetin，the product obtained may have two，peak area 48.9%.Quercetin by isopentenyl modification，the resulting products on hydroxyl radical and superoxide anion scavenging rate was significantly increased，but the removal of the DPPH radical was lower than that of quercetin.Conclusion：After quercetin was modified by isopentenyl，the resulting product was a new active compounds which have higher biological activity than quercetin.

quercetin；prenylation modification；free radicals；scavenging

TS201.2

A

1002-0306（2014）14-0084-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.009

2013－09－24

李梅（1973-），女，副教授，研究方向：食品安全。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071537）；佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)課題。