雙重PCR熔解曲線峰快速檢測食品中豬源性成分方法的建立

高 菲，蒲紅州，沈林園，蔣小兵，雷懷剛，沈 靜，李學(xué)偉，朱 礪，*（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川雅安6504；.四川省馬邊金涼山農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，四川馬邊64600）

雙重PCR熔解曲線峰快速檢測食品中豬源性成分方法的建立

高 菲1，蒲紅州1，沈林園1，蔣小兵1，雷懷剛1，沈 靜2，李學(xué)偉1，朱 礪1，*
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川雅安625014；2.四川省馬邊金涼山農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，四川馬邊614600）

基于國際生命條碼聯(lián)盟（CBOL，the Consortium for the Barcode of Life）提出的barcoding技術(shù)所確定的序列區(qū)域，針對豬的線粒體COⅠ基因序列設(shè)計特異性引物。為了避免食品中PCR抑制劑的影響，本實驗設(shè)置GCG（胰島素受體）基因125bp的純化片段為內(nèi)參照，控制假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，豬和GCG基因的特異性產(chǎn)物在79.2℃和75℃有特異性熔解峰。設(shè)置牛、羊、雞、兔、鼠和空白對照，均無擴增。測序結(jié)果表明，該豬特異性引物的PCR產(chǎn)物含有245bp的核苷酸序列與GenBank中相應(yīng)序列吻合；該方法檢出限為0.001%。

雙重熒光PCR，DNA條形碼，豬源性成分，細胞色素C氧化酶基因Ⅰ，內(nèi)參照

肉類食品作為人類膳食結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因價格差異、風俗習慣、疾病傳播等方面的原因，造成了食品摻假、檢驗防疫、宗教信仰等問題的出現(xiàn)。比如，用相對便宜的豬肉摻假牛、羊肉；豬肉被用在回族和伊斯蘭教人的食品中；疫情的傳播等。特別是將豬肉非法加工冒充牛、羊等其他肉類的行為，嚴重侵犯了消費者的利益。所以建立有效檢測豬源性成分的方法顯得特別重要[1-3]。

目前，主要的動物源性成分檢測方法以分子生物學(xué)為主[4]。在國外，已經(jīng)出現(xiàn)了常見物種的檢測試劑盒。但是試劑盒的靈敏度較低，且對樣品的質(zhì)量要求較高[5]。為了探究更為快速、靈敏的方法，本研究采用雙重SYBR GreenⅠReal-Time PCR技術(shù)。該技術(shù)能實時監(jiān)測PCR產(chǎn)物累積信號，得出準確的結(jié)果。這樣減少了以往電泳時繁瑣步驟的干擾，使檢測結(jié)果更加準確和靈敏。引入單拷貝基因GCG為內(nèi)參照基因，用來監(jiān)控抑制劑對PCR反應(yīng)的影響，避免了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。選擇DNA條形碼特定區(qū)域序列作為目的片段來檢測豬源性成分，為國際DNA條形碼計劃在分類學(xué)上的應(yīng)用，提供了佐證[6-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬、牛、羊、雞、兔、鼠等肌肉樣品 采自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)農(nóng)場；Takara DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products Kit、SYBR?Prime Script TMRT-PCR Kit購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA MarkerⅡ、蛋白酶K等 購自北京天根生化科技有限公司；chelex-100 購自成都博奧維新生物科技有限公司；COⅠ基因序列的上游引物P1：CTATCCCAGG ACGACTAAA，下游引物P2：TTGTGGCATACCATT GAG；GCG單拷貝基因序列的上游序列P3：GCAAC TGCTCCTTACCAATGAAA，下游引物P4：CAGAATG TCAGGCG-RTTCAGATAT 深圳華大基因科技有限公司。

Smart Spec TMPlus分光光度計、凝膠成像系統(tǒng)、iQTM5 Multicolor Real-TimePCR 美國BIO-RAD公司；離心機 德國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PCR引物的設(shè)計和合成 根據(jù)DNA條形碼技術(shù)的規(guī)定，用Primer Premier 5.0和Oilgo 6.0軟件，根據(jù)GenBank中豬的線粒體COⅠ基因序列設(shè)計引物；內(nèi)參照基因采用豬GCG（胰島素受體）單拷貝基因純化片段，并設(shè)計引物，使兩對引物的退火溫度在60℃左右。

1.2.2 DNA抽提 取出凍存在-80℃冰箱環(huán)境下的新鮮樣品，用研缽在液氮環(huán)境下碾碎，然后采用Chelex-100法抽提總DNA[9]。最后總DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 雙重PCR反應(yīng)體系的建立 通過溫度梯度PCR方法，分別探索豬引物GCG基因引物的退火溫度。在確定退火溫度以后，探索雙重實時熒光PCR反應(yīng)體系：該反應(yīng)總體系為20滋L，其中SYBR GreenⅠPreMix設(shè)置10、11、12、13滋L四個梯度，上下游引物（10滋mol/L）各1滋L，DNA模板（50ng/滋L）各1滋L，用DEPC水補至20滋L。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃，2min；95℃，30s；57℃，30s；72℃，1min，進行35次循環(huán)。在此前的反應(yīng)基礎(chǔ)上，優(yōu)化PCR體系中各物質(zhì)的最佳濃度。其中豬COⅠ基因引物和內(nèi)參基因引物的比例采用1滋L∶0.8滋L、1滋L∶0.9滋L、1滋L∶1滋L用量進行實驗；豬COⅠ基因模板和內(nèi)參基因模板DNA的采用2滋L∶2滋L、2滋L∶1.5滋L、2滋L∶1滋L、2滋L∶0.5滋L用量進行實驗。引物和模板采用一一配對的方式，總共16次組合，都采用同一退火溫度進行雙重實時熒光PCR擴增。

1.2.4 特異性檢測 分別選取牛、羊、雞、兔、鼠樣品的DNA為模板與豬肉樣品的陽性對照；用DEPC水代替DNA模板做陰性對照；并加入GCG基因片段和引物P3、P4作為內(nèi)參照，檢測模板中是否含有PCR抑制劑。

1.2.5 靈敏度檢測 將豬DNA模板樣品稀釋至0.1%、0.01%、0.001%、0.0001%的含量。取各濃度DNA 2滋L，并加入GCG基因片段DNA 1滋L共同作為模板，進行PCR靈敏度檢測。

1.2.6 樣品檢測 將牛、羊、雞、兔、鼠樣品的DNA做為模板進行檢測，評價該方法的可靠性。

1.2.7 PCR產(chǎn)物序列測定 將PCR產(chǎn)物純化后送深圳華大科技有限公司測序，檢驗產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重實時熒光PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化

通過溫度梯度PCR的結(jié)果，顯示兩個單重反應(yīng)的最適退火溫度為60℃。經(jīng)過對1.2.2的排列組合優(yōu)化篩選，2種引物的用量為1滋L∶0.8滋L；豬COⅠ基因模板和內(nèi)參照基因模板的用量分別為2滋L和1.5滋L。優(yōu)化后結(jié)果如圖1所示。能在不同溫度點形成清晰可見的峰圖，峰的熒光值都達到了4000以上，每個樣品中IPC都能在75℃時形成特異性的熔解曲線峰，豬源性成分的特異性熔解曲線在79.2℃形成。

圖1 豬源性成分特異性熔解曲線圖Fig.1 Porcine endogenous component-specific melting curves

2.2 方法特異性檢驗

將雞、狗、羊、兔、鼠樣品的DNA和豬樣品的DNA按1∶1混合，做為擴增模板，用于檢驗該方法的特異性。結(jié)果表明（見圖2），常見動物樣本DNA為模板和空白對照組都未在79.2℃形成特異性熔解峰（Ct＞35）。該結(jié)果表明，該方法特異性良好，且所有模板中不含有PCR抑制劑成分。

圖2 混合DNA中豬特異性熔解曲線Fig.2 Swine specific melting curve of mixed DNA template

2.3 方法靈敏度檢驗

根據(jù)上述實驗結(jié)果，進一步將豬DNA模板稀釋至含量為1%、0.01%、0.001%、0.0001%后再進行靈敏度檢驗。結(jié)果表明（見圖3），在PCR過程中只有0.0001%濃度沒有生產(chǎn)有效的熔解曲線峰。表明此SYBR GreenⅠRealtime-PCR熔解曲線法的檢出限為0.001%。

圖3 靈敏度檢測Fig.3 Sensitivity Detection

2.4 研究方法的驗證與應(yīng)用

在餐廳里買回兩份牛、羊肉樣品，在市場上購買了雞、兔、牛、羊肉樣品進行檢測，用于驗證本方法。檢測結(jié)果如圖4所示，燒烤餐廳的牛、羊肉有豬肉摻假。可能是因為豬肉比牛、羊肉便宜，且外觀上不容易分辨它們的差別。

圖4 實例檢測中豬源性特異性熔解曲線圖Fig.4 Porcine endogenous specific melting curves of examples of detection

2.5 測序驗證

特異性擴增片段的測序結(jié)果與GenBank相應(yīng)序列的比對結(jié)果表明，該片段全長245bp，位于豬線粒體細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（CO I）序列的3’端，該短序列具有相對適中的保守性，適合用于種屬鑒別。

3 討論

本實驗采集了商業(yè)肉制品進行驗證，顯示該方法實現(xiàn)了現(xiàn)代分子診斷技術(shù)快速、準確、大批量和經(jīng)濟的要求。本實驗使用了chelex-100法和商業(yè)DNA抽提試劑盒，提取樣品中的總DNA，能滿足濃度0.0001%含量的檢測要求。與傳統(tǒng)的凝膠電泳檢測方法比較，該方法不需要使用瓊脂糖凝膠、核酸染料等有害物質(zhì)，從而避免了污染環(huán)境。

雙重PCR溶解曲線峰快速檢測法最重要的兩個部分就是引物設(shè)計和退火溫度的設(shè)定。根據(jù)Arong Luo等[7，10-11]報道以線粒體DNA做為標記基因有以下四個優(yōu)點：覆蓋物種的數(shù)量多；種間和種內(nèi)的序列差異適中；能夠解決不同分類階元的問題；基因序列的突變率較低，與本實驗結(jié)果相符。Vrijenhoek等[12]提出，線粒體基因具有組織中含量大，無組織特異性，易于獲取等優(yōu)點。在實驗技術(shù)方面，特異性差的引物，在PCR過程中產(chǎn)生較多的非特異性擴增，影響實驗結(jié)果；引物擴增的產(chǎn)物過長或過短，引物的GC含量太高或太低都會影響該方法的熔解溫度（Tm值）。在減少誤差方面，本實驗采用以擴增內(nèi)參照GCG基因片段的方法來解決，促進了多重PCR的應(yīng)用，同時減少了誤差。在PCR過程中，GCG基因片段會與檢測目的片段競爭反應(yīng)體系中的dNTP。樣品DNA濃度偏低會導(dǎo)致，熔解曲線峰不明顯，太高可能抑制GCG基因片段的擴增。調(diào)節(jié)引物之間的濃度比和DNA濃度比，是該方法的另一關(guān)鍵步驟。

4 結(jié)論

通過實驗證明，P1、P2引物在豬源性成分的檢測中，具有很高的特異性，其檢出限為0.001%，滿足檢測條件。該方法可以用于食品中豬源性成分的特異性檢測。

[1]李巧玲，劉景艷.市場鮮豬肉摻假狀況的調(diào)查監(jiān)測[J].食品科學(xué)，2004，25（10）：273-276.

[2]羅家琴，王加啟，卜登攀，等.飼料中牛，羊，豬，雞源性成分的PCR檢測方法及其應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（7）：2112-2119.

[3]李家鵬，喬曉玲，田寒友，等.食品和飼料中動物源性成分檢測技術(shù)研究進展[J].食品科學(xué)，2011，32（9）：340-347.

[4]Nakyinsige K，Man YB，Sazili AQ.Halal authenticity issues in meat and meat products[J].Meat Sci，2012，91（3）：207-214.

[5]Chen SY，Liu YP，Yao YG.Species authentication of commercial beef jerky based on PCR-RFLP analysis of the mitochondrial 12S rRNA gene[J].Journal of Genetics and Genomics，2010，37（11）：763-769.

[6]Hebert PD，Ratnasingham S，deWaard JR.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci，2003，270（S1）：96-99.

[7]Luo A，Zhang A，Ho SY，et al.Potential efficacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding：a case study using eutherian mammals[J].BMC Genomics，2011（12）：84.

[8]Min XJ，Hickey DA.DNA barcodes provide a quick preview of mitochondrial genome composition[J].PLoS One，2007，2（3）：325.

[9]Walsh PS，Metzger DA，Higuchi R.Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material[J].Biotechniques，1991，10（4）：506.

[10]Hebert P，Gregory TR.The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy[J].Systematic Biology，2005，54（5）：852-859.

[11]Hebert PDN，Stoeckle MY，Zemlak TS，et al.Identification of birds through DNA barcodes[J].PLoS Biology，2004，2（10）：e312.

[12]Vrijenhoek R.DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J].Molecular Marine Biology and Biotechnology，1994，3（5）：294-299.

Establishment of duplex PCR melting curve for rapid identification of swine origins in foodstuff

GAO Fei1，PU Hong-zhou1，SHEN Lin-yuan1，JIANG Xiao-bing1，LEI Huai-gang1，SHEN Jing2，LI Xue-wei1，ZHU Li1，*
（1.College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，China；2.Mabian Gold Liangshan Agricultural Development Co.，Ltd.，Mabian 614600，China）

Primers specific to swine was designed for species-specific COⅠgene-amplification from barcoding was proposed by CBOL.Simultaneously in order to prevent false negative results，GCG gene fragment was used for the internal positive control（IPC）.Gene products of swine and GCG were represented in two melting peaks generated simultaneously at temperatures of 79.2℃and 75℃respectively.The specificity of the method was evaluated using template DNAs from bovine，chevon，chicken，rabbit，rat and NTC，whereas only amplification products of GCG gene were obtained.DNA sequencing results showed that the sequence of swine-specific products was 245bp，and which were 100%matching the corresponding sequence in the GenBank.The LOD of this method was 0.001%.

duplex SYBR green real-time PCR；DNA barcoding；swine；COⅠ；IPC

TS201.1

A

1002-0306（2014）14-0081-03

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.008

2013－01－05 *通訊聯(lián)系人

高菲（1987-），男，在讀研究生，研究方向：豬肉品質(zhì)。

四川省科技支撐計劃項目；國家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-36）；四川省“十二五”畜禽育種攻關(guān)項目（2011NZ0099-1）。