酶促乙酯化和分子蒸餾聯(lián)用制備高DHA乙酯的工藝

孫兆敏，張 芹，郭正霞，王靜鳳，李兆杰，薛 勇，王玉明，薛長湖（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

酶促乙酯化和分子蒸餾聯(lián)用制備高DHA乙酯的工藝

孫兆敏，張 芹，郭正霞，王靜鳳，李兆杰，薛 勇，王玉明，薛長湖*
（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

利用固定化脂肪酶催化乙酯化反應將裂殖壺菌總脂轉化為乙酯，并借助分子蒸餾手段制備得到了高DHA含量的乙酯產(chǎn)品。實驗考察了反應溫度、時間、底物質量配比和脂肪酶添加量等參數(shù)對酶促乙酯化反應的影響。在較優(yōu)條件下（反應溫度40℃，反應時間24h，底物質量比10∶2，Lipozyme 435添加量為油脂質量的6%），固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性良好。采用分子蒸餾技術富集酶促醇解所得裂殖壺菌乙酯中的DHA，可得到DHA含量高于80%的乙酯產(chǎn)品，通過多級分子蒸餾和將輕相組分回流的方式可以顯著提高DHA含量乙酯的得率。

裂殖壺菌，乙酯化，分子蒸餾，DHA

二十二碳六烯酸（DHA）是一種重要的n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA），它是嬰幼兒的生長發(fā)育和維持大腦的正常認知功能不可或缺的物質[1]。裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）是目前工業(yè)發(fā)酵制備DHA的理想菌種之一，其產(chǎn)生的油脂可達細胞干重的70%以上，而DHA的含量則多在35%～45%范圍內(nèi)[2]，是制備高含量DHA產(chǎn)品的優(yōu)良原料。

脂肪酸乙酯或甲酯的制備通常采用化學法，即采用堿性化合物（如LiOH、NaOH、CH3ONa等）[3-7]為催化劑在高溫條件反應，反應過程易引起中性脂的皂化、產(chǎn)物不易于分離純化且產(chǎn)生大量污染環(huán)境的廢棄物；以脂肪酶作為催化劑的反應具有反應條件溫和、效率高和產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)點[8]。目前利用脂肪酶催乙酯化反應的研究多集中在生物柴油[9-11]和富含n-3PUFA的甘油酯的酶法制備[12-13]方面。分子蒸餾技術可在遠低于物料沸點的溫度條件下進行分離，蒸餾壓力低，受熱時間短，特別適于高沸點、易氧化、熱敏性物質的分離，且不涉及對環(huán)境有害的廢棄物的排放，目前該技術已經(jīng)應用于維生素E、單甘油酯、L-乳酸等的提取和精制以及n-3 PUFA的富集等領域[14-16]。

本研究擬采用固定化脂肪酶為催化劑，催化裂殖壺菌總脂與乙醇的醇解反應制備含DHA的乙酯，并通過分子蒸餾法進一步富集乙酯中的DHA，得到高DHA含量的乙酯產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂殖壺菌（Schizochytrium sp.）干粉 廈門匯盛生物有限公司；固定化脂肪酶Lipozyme 435（活力為76.33U/g） 天津諾維信公司。

6890N氣相色譜儀、1100型液相色譜儀 美國Agilent公司；ELSD2000型蒸發(fā)光散射檢測器 美國Alltech公司；KDL-1型分子蒸餾設備 德國UIC公司；Laborota4000型旋轉蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 裂殖壺菌總脂的提取 稱取500g裂殖壺菌干粉加入1.5L氯仿-甲醇混合液（2∶1，V/V）攪拌提取30min，抽濾得到濾液減壓濃縮至1.0L后加入5%NaCl溶液400mL充分振蕩，靜置分層取下層氯仿相，過無水硫酸鈉脫水后于45℃、-0.08MPa條件下旋轉蒸發(fā)脫除氯仿，得到黃色裂殖壺菌總脂。

1.2.2 裂殖壺菌總脂的酶促乙酯化 稱取裂殖壺菌總脂、無水乙醇以及固定化脂肪酶Lipozyme 435加入具塞三角瓶中，充氮氣后密封，置于振蕩水浴搖床中分別在不同溫度下反應一定時間。反應完畢后過濾取濾液于60℃、-0.08MPa條件下旋轉蒸發(fā)脫除未反應的乙醇，取樣溶于正己烷-異丙醇混合液（1∶1，V/V），液相色譜法測定其脂質組成，計算酯化率。

1.2.3 裂殖壺菌乙酯的分子蒸餾 將酶促乙酯化制備得到的裂殖壺菌乙酯產(chǎn)物經(jīng)水洗、脫色、脫水后進行分子蒸餾。首先在不同蒸餾溫度下進行單級分子蒸餾，收集重相組分分析其脂肪酸組成，再進行多級分子蒸餾制備高DHA含量的乙酯產(chǎn)品，單級分子蒸餾和多級分子蒸餾各級蒸餾單元的刮片轉速為170r/min，蒸餾壓力為0.1Pa，進料速度為4mL/min，其高DHA乙酯得率即為分子蒸餾重相組分占進料量的百分比。

1.2.4 脂質組成測定 反應混合物的脂質組成測定采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用（HPLCELSD）的方法[17]，其條件如下：a.色譜條件：液相色譜儀為Agilent1100型液相色譜儀；流動相采用正己烷-異丙醇-乙酸（90∶10∶0.2，V/V/V），流速為0.8mL/min，每個樣品分析時間為12min；分析柱選用Rx-SIL型正相硅膠色譜柱，柱溫35℃；b.ELSD條件：以99.9%氮氣為霧化氣，流量為1.4L/min；撞擊器處于關閉模式；漂移管溫度為60℃。根據(jù)計算機采集的數(shù)據(jù)進行積分計算各組分峰面積，代入標準曲線計算各組分在樣品中的質量，計算各組分在反應混合物中的含量，酯化率（ED）和DHA酯化率（ED of DHA）的計算公式如下：

式中：m（EE）—樣品中乙酯（EE）的質量，mg；m’（EE）—理論上裂殖壺菌總脂能轉化成的EE質量，mg；A—一定反應時間EE中DHA的含量，%；A’—裂殖壺菌總脂中DHA的含量，%。

1.2.5 脂肪酸組成測定 脂肪酸組成的測定采用氣相色譜法，其樣品衍生和檢測條件如下：a.反應混合物的甲酯化：取約10μL樣品點樣于硅膠G薄層色譜板上，于正己烷-乙醚-乙酸（85∶15∶1，V/V）體系中展開，硅膠板揮干溶劑后碘缸略微顯色，刮下各條帶于10mL具塞試管中，加入10%H2SO4-甲醇溶液1mL后于60℃水浴加熱15min，之后加入0.4mL正己烷充分振蕩，靜置分層，取正己烷層脫水過膜后密封冷藏待測。b.氣相色譜條件條件：進樣口溫度為250℃，分流比為20∶1；分析柱選用HP-INNOWax石英毛細管柱（30m×0.32mm×0.25μm），采用梯度升溫，初始溫度為170℃，以3℃/min升溫至210℃并保持13min，其載氣（高純氮氣）流速為1mL/min；檢測器為火焰離子化檢測器（FID），檢測器溫度280℃。

2 結果與討論

2.1 裂殖壺菌總脂脂肪酸測定

裂殖壺菌干粉經(jīng)氯仿-甲醇法提取總脂后，采用氣相色譜法測定了其脂肪酸組成。實驗選用的裂殖壺菌干粉總脂中的脂肪酸組成較為簡單，主要含有六種脂肪酸，分別為：23.89%C16∶0、2.33%C18∶0、6.27%C18∶1、16.94%C18∶2、8.69%C22∶5 n-6和41.69% C22∶6 n-3（DHA），包括了飽和脂肪酸（26.22%）、單不飽和脂肪酸（6.27%）和多不飽和脂肪酸（67.32%）。

圖1 裂殖壺菌總脂脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 The GC chromatogram of fatty acids in total lipids of Schizochytrium sp.

圖2 反應溫度對酶促乙酯化反應的影響Fig.2 Effect of temperature on enzymatic ethylation

2.2 溫度對酶促乙酯化的影響

溫度能夠改變反應體系的黏度和酶的活力。隨著溫度的升高，反應體系的黏度下降，反應底物和產(chǎn)物的傳質效率得到提高，在一定的溫度范圍內(nèi)，酶活力隨溫度的升高而提高，但過高的溫度則會引起酶蛋白的變性失活。實驗在底物質量比（裂殖壺菌總脂與無水乙醇的質量比）為10∶3、固定化脂肪酶添加量3%、反應時間24h的條件下，選取了30、40、50、60℃四個溫度來考察溫度對酶促乙酯化反應的影響。由圖2可知，在30℃的溫度條件下，反應的乙酯化率和DHA酯化率分別為59.19%和45.90%；提高溫度至40℃，乙酯化率、乙酯中DHA的含量和DHA酯化率都達到最高；提高溫度至50℃和60℃，Lipozyme 435的催化效率甚至低于30℃的反應結果，可能原因是極性較強的乙醇和高溫的共同作用導致酶活力的降低。根據(jù)以上的實驗結果，選用40℃作為后續(xù)研究的溫度條件。

2.3 反應時間對酶促乙酯化的影響

實驗在反應溫度40℃、底物質量比10∶3、固定化脂肪酶添加量3%的條件下，于不同反應時間取樣測定其脂質組成和各組分的脂肪酸組成，以考察反應時間對酶促乙酯化反應的影響，其結果如圖3所示。反應初期的底物濃度高，反應速度較快。在所選的實驗條件下反應2h，裂殖壺菌總脂的酯化率和DHA酯化率分別達到25.00%和12.38%，當反應至4h時，酯化率和DHA酯化率分別為39.59%和22.31%，與前2h相比反應速度有所降低，由于底物的消耗，4h后的反應速度進一步降低，當反應至12h時，酯化率和DHA酯化率分別達到63.46%和45.10%，而反應時間為24h時基本達到平衡，因此選取24h作為后續(xù)研究的反應時間。

圖3 反應時間對酶促乙酯化反應的影響Fig.3 Effect of reaction time on enzymatic ethylation

圖3 所示DHA酯化率的曲線在反應過程中一直低于酯化率的曲線，表明裂殖壺菌總脂中的DHA酯化率一直低于總脂肪酸的酯化率，說明Lipozyme 435在反應過程中可能優(yōu)先催化飽和脂肪酸和低不飽和度的脂肪酸參與乙酯化反應，表現(xiàn)出一定的脂肪酸選擇性，相同的結論也可以通過圖3中乙酯的DHA含量隨反應時間的變化曲線得出。

2.4 底物質量比對酶促乙酯化的影響

實驗在反應溫度40℃、反應時間24h、脂肪酶添加量3%的條件下，考察了底物質量比對酶促乙酯化反應的影響。由圖4可知，當?shù)孜镔|量比為10∶1時，乙醇的添加量在理論上不足以使裂殖壺菌總脂完全反應，在實驗所選的條件下反應24h，其酯化率和DHA酯化率分別為49.47%和52.60%；底物質量比為10∶2時，酯化率和DHA酯化率為最高，分別為86.72%和87.42%；之后隨著底物質量比的降低（乙醇添加量的增加），酯化率和DHA酯化率逐漸降低，且底物比為10∶8和10∶10的時候，乙酯化反應結果基本相同。由于乙醇和甘油三酯難于互溶，降低底物質量比（即反應體系中乙醇量的增加），其直接的結果是影響反應底物的混合以及固定化酶在反應體系的均勻分布，從而降低脂肪酶的催化效率；由于乙醇的極性較強，向反應體系中加入過高的乙醇不利于酶活力穩(wěn)定性的保持[18-21]。實驗所選取的最優(yōu)底物質量比為10∶2，在反應開始之前，反應體系呈微乳狀，脂肪酶催化醇解反應產(chǎn)生脂肪酸乙酯、甘油二酯和單甘油酯等產(chǎn)物，其中脂肪酸乙酯可與乙醇互溶，而甘油二酯和單甘油酯存在羥基基團，其對乙醇的溶解性大大增強，乙酯化反應30min，反應混合物即可互溶成為均一透明的液體（數(shù)據(jù)未列出），而增加酶量則可能更利于加快該進程。另外，乙酯中的DHA含量隨底物質量比的降低而降低，說明反應體系中乙醇量的增加會導致DHA在甘油酯中的富集。

圖4 底物質量比對酶促乙酯化反應的影響Fig.4 Effect of substrate ratio on enzymatic ethylation

2.5 脂肪酶添加量對酶促乙酯化的影響

為考察脂肪酶添加量對酶促乙酯化反應的影響，在反應溫度40℃、底物質量比10∶2條件下，選取1%、2%、3%、4%、6%、8%和10%七個脂肪酶添加量進行實驗，反應24h后測定乙酯化指標，結果如圖5所示。脂肪酶的添加量小于4%時，乙酯中DHA的含量隨酶量的增加而緩慢提高，直到脂肪酶添加量增加到4%，乙酯中DHA的含量達到與原料裂殖壺菌總脂相同的水平，繼續(xù)增加酶量至6%，DHA酯化率不再低于乙酯化率，二者均接近100%。脂肪酶添加量較低時，乙酯化率和DHA酯化率較低的原因之一可能是反應產(chǎn)生甘油對固定化酶的包裹作用，加大酶量可能在一定程度上“稀釋”了這種包裹作用。根據(jù)以上的結果，選擇脂肪酶添加量6%進行后續(xù)研究。

圖5 酶添加量對酶促乙酯化反應的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage on enzymatic ethylation

2.6 固定化酶的重復利用

隨著酶促乙酯化反應的進行，當甘油骨架上的脂肪酸被完全乙酯化后，反應體系中，甘油黏度和密度高，且不溶于反應體系，易于包裹固定化酶顆粒阻礙底物與固定化酶的接觸，從而阻礙反應的進行。Shimada等[22]在考察脂肪酶的操作穩(wěn)定性時，發(fā)現(xiàn)甘油積累在固定化酶表面，需要定時用溶劑清洗。

由于實驗選用的脂肪酶添加量較大，可在一定程度上減小甘油對固定化酶的包裹作用，實驗在如下條件進行以考察固定化酶的操作穩(wěn)定性：底物質量比10∶2，Lipozyme 435添加量為油脂質量的6%，反應溫度40℃，反應時間24h。每一批反應完畢后過濾，固定化酶經(jīng)叔丁醇洗滌后直接加入新配制的底物混合液中進行下一次反應，實驗共進行20次，其結果如圖6所示。

圖6 固定化脂肪酶的重復利用Fig.6 The reuse of immobilized lipase

由圖6可知，經(jīng)過20批次的反應，在所選的條件下反應24h，酯化率和DHA酯化率沒有明顯的降低，其酯化率和DHA酯化率分別為98.44%和97.95%。將20批次反應所得油脂混合物合并，經(jīng)5%NaCl溶液洗滌三次后脫水過0.45μm有機膜，得到黃色的乙酯產(chǎn)品，其DHA含量為40.91%。

2.7 裂殖壺菌乙酯的分子蒸餾

在刮片轉速170r/min、蒸餾壓力0.1Pa、進料速度4mL/min的條件下，將酶促乙酯化所得裂殖壺菌乙酯于不同溫度進行單級分子蒸餾，收集重相組分測定脂肪酸組成，所得結果如圖7所示。

圖7 溫度對分子蒸餾重相脂肪酸組成的影響Fig.7 Effect of temperature on the fatty acid composition of heavy fractions of molecular distillation

在80～130℃范圍內(nèi)，隨著蒸餾溫度的升高，重相組分中DHA含量不斷提高，當溫度達到130℃時，重相中DHA和C22∶5n-6含量達到81.72%和15.86%，由于兩種脂肪酸乙酯的分子自由程差異較小，在實驗室條件下無法通過提高溫度進一步提高DHA的含量，當提高蒸餾溫度至140℃時，裂殖壺菌乙酯全部成為輕相。

圖8 三級分子蒸餾重相脂肪酸組成氣相色譜圖Fig.8 The GC chromatogram of fatty acids in heavy fraction of three-stage procedure of molecular distillation

表1 六級分子蒸餾結果（90℃-90℃-100℃-100℃-110℃-110℃）Table 1 Results of six-stage procedure（90℃-90℃-100℃-100℃-110℃-110℃）of molecular distillation

表2 三級分子蒸餾結果（100℃-100℃-110℃）Table 2 Results of three-stage procedure（100℃-100℃-110℃）of molecular distillation

雖然采用單級分子蒸餾在130℃條件下可得到DHA含量在80%以上的乙酯產(chǎn)品，但高DHA乙酯得率較低（僅21.19%）。通過多級分子蒸餾不僅可以提高最終產(chǎn)品的得率，還能在得到相同DHA含量的產(chǎn)品的前提下，降低蒸餾溫度。多級分子蒸餾首先在較低的溫度下進行分子蒸餾，收集重相組分于下一級溫度條件進行蒸餾，多級分子蒸餾的刮片轉速、蒸餾壓力和進料速度均與單級分子蒸餾相同。表1和表2分別是采用六級分子蒸餾和三級分子蒸餾富集DHA乙酯的結果。比較可知，在三級分子蒸餾過程中，每級重相中DHA含量都低于六級分子蒸餾時相同溫度下所得到的重相中DHA含量，最終產(chǎn)品中DHA的含量僅比六級分子蒸餾低0.66%。

六級和三級分子蒸餾最終高DHA乙酯的得率分別增加到30.96%和33.12%。在多級分子蒸餾的升溫過程中，輕相組分中的DHA含量隨蒸餾溫度的升高而增加，六級分子蒸餾所得輕相組分中DHA的含量依次為0%、2.61%、23.94%、39.95%、59.99%和73.37%，而三級分子蒸餾所得輕相組分中DHA的含量依次為7.10%、19.14%和47.84%，在多級分子蒸餾過程中，將高DHA含量的輕相組分回流繼續(xù)進行蒸餾，可進一步提高產(chǎn)品的得率，如將六級分子蒸餾中第四級輕相與第一級的進料混合，將第五級輕相與第二級的進料混合，將第六級輕相與第三級進料混合，可將六級分子蒸餾的產(chǎn)品得率由30.96%提高至36.45%。

3 結論

利用脂肪酶催化乙酯化反應將含40%以上DHA的裂殖壺菌總脂轉化為乙酯，并借助分子蒸餾手段制備得到DHA含量高于80%的乙酯產(chǎn)品。采用固定化脂肪酶為催化劑可將裂殖壺菌總脂轉化為乙酯，相對于化學法，該法具有條件溫和、不產(chǎn)生廢棄物和產(chǎn)物易于分離純化等優(yōu)點。在所得較優(yōu)反應條件下（反應溫度40℃，反應時間24h，底物質量比10∶2，Lipozyme 435添加量為油脂質量的6%），固定化脂肪酶的操作穩(wěn)定性良好，反應20批次裂殖壺菌總脂酯化率未出現(xiàn)明顯降低。分子蒸餾可有效地富集酶促乙酯化所得乙酯中的DHA，而多級分子蒸餾和將較高DHA含量的輕相組分回流繼續(xù)進行蒸餾，可提高高DHA含量產(chǎn)品的得率。

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Preparation of ethyl esters highly enriched in DHA via enzymatic ethylation and molecular distillation

SUN Zhao-min，ZHANG Qin，GUO Zheng-xia，WANG Jing-feng，LI Zhao-jie，XUE Yong，WANG Yu-ming，XUE Chang-hu*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

In the present study，the total lipids from Schizochytrium sp.were ethylated by immobilized lipase and ethyl esters highly enriched in C22∶6 n-3（DHA）was obtained through molecular distillation.The effect of temperature，reaction time，substrate ratio，and enzyme dosage on enzymatic ethylation was investigated.Under optimum reaction conditions（reaction temperature 40℃，reaction time 24h，substrate ratio 10∶2，Lipozyme 435 dosage 6%），immobilized lipase had good operational stability.Ethyl esters with no less than 80%DHA was obtained via molecular distillation，and the yield of DHA ethyl esters could be significantly improved by multistage molecular distillation and recycle of light fractions.

Schizochytrium sp.；ethylation；molecular distillation；DHA

TS225.6

A

1002-0306（2014）12-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.027

2013－09－24 *通訊聯(lián)系人

孫兆敏（1983-），男，博士，研究方向：水產(chǎn)化學。

“泰山學者”建設工程專項經(jīng)費；長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助；海洋公益性行業(yè)專項（201105029）；國際科技合作項目（2010DFA31330）；山東省科技發(fā)展計劃（2012G0021506）。