軟肝化堅顆粒對肝纖維化C57小鼠體內(nèi)羥脯氨酸的影響※

楊莉 劉蓮 馮愛東 趙金超 王玉澤 戴二黑

（河北省石家莊市第五醫(yī)院檢驗科，河北石家莊 050021）

肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是肝硬化發(fā)生的前奏和必經(jīng)中間環(huán)節(jié)。肝纖維化是各種慢性肝病進展過程中由于肝內(nèi)纖維生成與降解失衡，導(dǎo)致過多的膠原在肝內(nèi)沉積所致［1］。軟肝化堅顆粒具有益氣活血、軟堅化結(jié)之功效，是河北省石家莊市第五醫(yī)院自行研制的用于抗肝纖維化及早期肝硬化的治療藥物，經(jīng)多年臨床觀察，療效顯著［2］。本研究通過四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的C57小鼠肝纖維化模型，觀察軟肝化堅顆粒對C57小鼠肝纖維化模型血清及肝組織中羥脯氨酸（Hyp）的影響，進一步探討軟肝化堅顆粒對肝纖維化形成過程中膠原分泌的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57小鼠40只，雄性，無特定病原體級（SPF），體質(zhì)量（20±3）g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心購進，動物合格證號:0029674。

1.2 實驗藥物軟肝化堅顆粒（批號:090318，冀藥制字Z20051044，由河北省石家莊市第五醫(yī)院制劑室提供）。CCl4由天津市標(biāo)準(zhǔn)件科技有限公司生產(chǎn)。秋水仙堿（陽性對照藥）由通化百信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。0.9%氯化鈉注射液由石家莊四藥有限公司生產(chǎn)。橄欖油由上海晶純試劑有限公司生產(chǎn)。檢測血清Hyp、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）和Ⅰ型膠原的酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒由R＆D公司生產(chǎn)。肝組織Hyp檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器芬蘭Thermo公司生產(chǎn)MK3型全自動酶標(biāo)儀，尤尼柯（上海）儀器有限公司生產(chǎn)的UV-2000型分光光度計。

1.4 實驗方法

1.4.1 模型制備及分組實驗C57小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為4組，每組10只，分別為正常對照組、模型對照組、模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組。實驗開始后每周一、四給予正常對照組C57小鼠腹腔注射橄欖油（橄欖油用量0.1 mL/10 g體質(zhì)量，每日1次）;模型對照組、模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組腹腔注射10%CCl4造模（10%CCl4用量按0.1 mL/10 g體質(zhì)量，每日1次）。每次腹腔注射前均測量小鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量注射相應(yīng)劑量的10%CCl4，并詳細記錄。2周后，于繼續(xù)造模的同時，正常對照組、模型對照組每日予0.9%氯化鈉注射液灌胃［0.9%氯化鈉注射液用量為（0.2 mL/ （次·只），每日1次］，模型軟肝化堅顆粒組用軟肝化堅顆粒以臨床使用劑量進行灌胃［藥物用量為0.1 g/ （只·d），每日1次］，模型秋水仙堿組用秋水仙堿灌胃［藥物用量為0.003 mg/（只·d），每日1次］。連續(xù)用藥治療6周。

1.4.2 標(biāo)本的收集與處理各組實驗小鼠分別在用藥的第6周最后1次腹腔注射后4 h，登記編號，記錄狀態(tài)，稱質(zhì)量后給予4%水合氯醛腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血，分離血清備用。分離剝?nèi)⌒∈蟾谓M織，于液氮中保存?zhèn)溆?。實驗過程中模型對照組死亡3只，模型軟肝化堅顆粒組死亡1只，模型秋水仙堿組死亡1只。

1.4.3 血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型膠原檢測采用ELISA法測定小鼠血清中Hyp、TGF-β1和Ⅰ型膠原的含量，嚴(yán)格按說明書操作。

1.4.4 肝組織Hyp檢測采用樣本堿水解法測定小鼠肝組織中Hyp的含量，嚴(yán)格按說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，同一指標(biāo)的組間比較采用方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清Hyp、TGF-β1及Ⅰ型膠原含量比較見表1。

表1 各組小鼠血清Hyp、Ⅰ型膠原及TGF-β1含量比較±s

表1 各組小鼠血清Hyp、Ⅰ型膠原及TGF-β1含量比較±s

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型對照組比較，△P＜0.05

組別nHyp（μg/mL）Ⅰ型膠原（ng/mL）TGF-β1（pg/mL）正常對照組102.83±0.5867.82±26.966 395.46±4 650.11模型對照組74.99±1.64*272.57±82.73*2 3859.90±3 176.49*模型軟肝化堅顆粒組93.44±0.64△93.78±39.59△5 961.87±6 206.02△模型秋水仙堿組93.24±0.69△74.17±51.50△6 960.98±3 559.64△

由表1可見，與正常對照組比較，模型對照組血清中Hyp、TGF-β1和Ⅰ型膠原的含量升高（P＜0.05），模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組小鼠血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型膠原的含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;與模型對照組比較，模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組小鼠血清Hyp、TGF-β1和Ⅰ型膠原的含量均降低（P＜0.05）。

2.2 各組小鼠肝組織中Hyp含量比較見表2。

表2 各組小鼠肝組織Hyp含量比較±s

表2 各組小鼠肝組織Hyp含量比較±s

與正常對照組比較，*P＜0.05;與模型對照組比較，△P＜0.05;與模型軟肝化堅顆粒組比較，#P＜0.05

組別n肝組織Hyp水平（μg/g）正常對照組10135.99±136.95模型對照組7359.50±148.73*模型軟肝化堅顆粒組9109.26±34.78△模型秋水仙堿組9231.93±78.54△#

由表2可見，與正常對照組比較，模型對照組肝組織中Hyp的含量升高（P＜0.05），模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組小鼠肝組織Hyp的含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）;與模型對照組比較，模型軟肝化堅顆粒組和模型秋水仙堿組小鼠肝組織Hyp的含量均降低（P＜0.05）;與模型秋水仙堿組比較，模型軟肝化堅顆粒組小鼠肝組織Hyp的含量降低（P＜0.05）。

3 討論

肝纖維化屬中醫(yī)學(xué)瘕積等范疇，是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝纖維化的致病機制為“氣滯血瘀”，倡導(dǎo)以活血化瘀為主治療本?。?］。軟肝化堅顆粒方中丹參活血化瘀;黃芪益氣健脾，扶助正氣;水蛭、三棱、莪術(shù)活血通絡(luò)，軟堅消癥;當(dāng)歸、白芍藥養(yǎng)血柔肝，緩和藥性。諸藥合用，共奏活血化瘀、益氣健脾之功。本研究通過CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型研究軟肝化堅顆粒在抗肝纖維化治療中對膠原產(chǎn)生及降解的機制進行探討。本研究結(jié)果顯示，模型軟肝化堅顆粒組小鼠血清中Ⅰ型膠原的含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與模型對照組比較則含量明顯降低（P＜0.05）。肝纖維化主要由過多細胞外基質(zhì)（ECM）在肝內(nèi)沉積所致，而肝臟ECM以膠原為主要成分，主要是Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型膠原，尤其是Ⅰ型膠原是肝纖維間隔的重要來源。本研究結(jié)果軟肝化堅顆粒組小鼠血清中Ⅰ型膠原的含量與模型對照組相比降低（P＜0.05），顯示肝纖維化中膠原產(chǎn)生及降解是軟肝化堅顆?？垢卫w維化的一個作用點，抑制膠原的產(chǎn)生或是促進膠原的降解。

細胞外基質(zhì)成分主要有4種，它們是膠原蛋白、彈性蛋白、蛋白多糖及糖粘連蛋白。由于Hyp占膠原蛋白含量的12.2%，彈性蛋白含有少量Hyp（約l%）外，蛋白多糖及糖粘連蛋白均不含Hyp，因此測定Hyp含量可以反映膠原蛋白及ECM的含量［4］。膠原降解后，Hyp不再重復(fù)利用，尤其活動性肝纖維化時，膠原合成、降解的速度均增加，導(dǎo)致血清Hyp升高，故血清Hyp水平可間接反映體內(nèi)膠原代謝情況［4］。本實驗結(jié)果顯示，模型軟肝化堅顆粒組小鼠血清中Hyp的含量與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與模型對照組相比，則含量降低（P＜0.05）。說明模型軟肝化堅顆粒組膠原的降解量明顯減少。而模型軟肝化堅顆粒組小鼠肝組織Hyp的含量與模型對照組相比，其含量降低（P＜0.05）。這說明模型軟肝化堅顆粒組小鼠肝組織膠原產(chǎn)生亦明顯降低，軟肝化堅顆粒通過抑制膠原產(chǎn)生和降解共同發(fā)揮抗肝纖維化作用。

TGF-β1是促進肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活和ECM合成的主要細胞因子之一，可通過TGFβ/Smad信號通路激活HSC，抑制TGF-β1及其信導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)將抑制HSC的激活，可抑制膠原的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，模型軟肝化堅顆粒組小鼠血清中TGF-β1的含量與模型對照組相比降低（P＜0.05），而在我們以前的研究中通過免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)軟肝化堅顆粒可抑制C57肝纖維化小鼠肝組織中TGF-β1的表達減少［6］，這說明軟肝化堅顆粒可通過抑制TGF-β1產(chǎn)生，抑制HSC的活化，從而抑制膠原的形成是軟肝化堅顆?？垢卫w維的機制之一。

另外，研究顯示模型軟肝化堅顆粒組肝組織中Hyp的含量明顯低于秋水仙堿組，這說明軟肝化堅顆粒的抗纖維化作用比秋水仙堿的作用更好，而且無副作用，值得更廣泛的推廣?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)軟肝化堅顆?？梢杂行Ы档托∈蟾谓M織和血清中Hyp的含量，這可能是軟肝化堅顆粒防治肝纖維化的機制之一。

［1］張麗華，呂莉莉，張亞囡，等.柴胡總皂苷肝毒性肝纖維化損傷機制研究［J］.中國藥物警戒，2012，9（11）:652-655.

［2］鄭浩杰，侯軍良，李軍生，等.軟肝化堅顆粒對慢性乙型肝炎患者肝纖維化血清標(biāo)志物影響的臨床觀察［J］.河北醫(yī)藥，2011，33（21）:3333-3334.

［3］劉宏，賈彥，楊婧，等.膈下逐瘀湯對免疫性肝纖維化大鼠肝組織MMP-9和TIMP-2表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（2）:450-453.

［4］李珊，蔡銳，伍參榮.加味四逆散對血吸蟲病小鼠肝纖維化相關(guān)因子表達的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2011，18 （2）:41-43.

［5］潘亮，楊大明.血清羥脯氨酸含量在實驗性肝纖維化中的變化［J］.南通醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2004，24（2）:136-137.

［6］葉立紅，王翀奎，楊莉，等.軟肝化堅顆粒對肝纖維化模型C57小鼠肝組織α-SMA、TGFβ1表達和Ⅰ型膠原水平的影響［J］.臨床肝膽病雜志，2012，28（9）:685-688.

（本文編輯:董軍杰）