人結(jié)腸癌細(xì)胞中CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位差異表達(dá)基因的驗(yàn)證*

王安萍 趙盈盈 劉 欣 翟惠虹

鈣周期素結(jié)合蛋白（CacyBP/SIP）是一種可以和鈣周期素（S100A6）結(jié)合大小約30 ku的蛋白質(zhì)。在結(jié)腸癌細(xì)胞中CacyBP/SIP主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，研究發(fā)現(xiàn)胃泌素、KCl[1]等作為刺激因子及缺氧[2]狀態(tài)可使CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位。為篩選出CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位下游差異表達(dá)基因，本課題組在前期工作中成功構(gòu)建了hCacyBP/SIP基因的胞核定位載體[3]，并將載體成功包裝入慢病毒，取病毒上清和陰性對(duì)照上清感染人源性結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，完成細(xì)胞周期聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）芯片，共篩選出88個(gè)差異表達(dá)基因。為排除人為導(dǎo)致胞核中CacyBP/SIP過(guò)表達(dá)篩選出差異表達(dá)基因的假陽(yáng)性，同時(shí)明確在生理?xiàng)l件下CacyBP/SIP發(fā)生核轉(zhuǎn)位后是否有相同差異表達(dá)基因，本研究選取差異表達(dá)倍數(shù)大于2的基因周期素依賴性蛋白激酶8（cyclin dependent kinase 8，CDK8）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶亞基2（cyclin depen?dent kinase subunit 2，CKS2），并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人源性結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)；RPMI-1640培養(yǎng)液為Hyclon公司，胎牛血清、0.25%胰酶購(gòu)自Gibco公司，胞漿、胞核蛋白抽提試劑盒及BCA蛋白定量試劑盒為南京凱基公司，胃泌素購(gòu)自Abcam公司，CacyBP/SIP兔抗人單抗購(gòu)自CST公司，PCNA鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自Abbkine公司，β-actin鼠抗人單抗、辣根酶標(biāo)記羊抗兔/鼠IgG購(gòu)自北京中杉。Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒為MBI公司產(chǎn)品，熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自promega公司，引物序列由上海生工生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞SW480在37℃、5% CO2、10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，更換為無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組SW480細(xì)胞繼續(xù)無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞更換胃泌素濃度為1×10-7mol/L的無(wú)血清、無(wú)雙抗培養(yǎng)液分別培養(yǎng)24、48 h。

1.2.2 免疫蛋白印跡（Western blot）檢測(cè)胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá) 棄去培養(yǎng)液按試劑盒說(shuō)明分別提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞胞漿、胞核蛋白，BCA法蛋白定量。10%分離膠，110 V電壓電泳120 min。半干轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2～4 h，孵育一抗anti-CacyBP/SIP（1∶600），4℃過(guò)夜，二抗HRP標(biāo)記羊抗兔（1∶5 000），洗膜，曝光。胞漿蛋白內(nèi)參β-actin（1∶400），胞核蛋白內(nèi)參PCNA（1∶1 000)。

1.2.3 細(xì)胞總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄 Triozl法分別提取實(shí)驗(yàn)組胃泌素作用48 h的SW480細(xì)胞和對(duì)照組SW480細(xì)胞總RNA，檢測(cè)光密度（OD）值在1.8～2.1之間的RNA,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)胃泌素刺激前后CDK8、CKS2基因表達(dá)水平 cDNA模板2 μL，上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），2×Go Taq?Master PCR Mix 10 μL，無(wú)酶水補(bǔ)充為總體積至20 μL反應(yīng)體系；反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃2 min;擴(kuò)增反應(yīng)95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s。檢測(cè)熒光，共55個(gè)循環(huán)。平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。擴(kuò)增反應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)結(jié)束后得到每個(gè)目的基因和管家基因β-actin的Ct值，用目的基因和管家基因Ct值差值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；用2-△△Ct法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組基因差異表達(dá)倍數(shù)。

Table 1 The PCR primer and the Tm of genes表1 PCR擴(kuò)增反上下引物序列及Tm值

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SSPS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在細(xì)胞內(nèi)的定位和表達(dá) 選胃泌素作為刺激因子，誘導(dǎo)CacyBP/SIP發(fā)生核轉(zhuǎn)位。無(wú)胃泌素刺激時(shí)CacyBP/SIP主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，胞核中僅少量表達(dá)。給予1×10-7mol/L胃泌素分別刺激24、48 h后，可同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中檢測(cè)到CacyBP/SIP的表達(dá)，見(jiàn)圖1。且胃泌素作用48 h的效果較24 h明顯，說(shuō)明胃泌素成功誘導(dǎo)CacyBP/SIP入核。

Figure 1 The expression of CacyBP/SIP in cytoplasm and nuclear detected by Western blot assay before and after stimulation圖1 Western blot檢測(cè)胃泌素刺激前后CacyBP/SIP在胞質(zhì)及胞核中的定位

2.2 qRT-PCR結(jié)果 在CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位前后，基因CDK8和CKS2在細(xì)胞SW480中的變化差異方向同芯片結(jié)果一致，CDK8和CKS2兩目的基因均表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖2、3。且實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中兩基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。其中基因CDK8的倍數(shù)變化為2.38，基因CKS2的倍數(shù)變化為2.25。

Figure 2 The amplification curves of real-time quantitative PCR圖2 qRT-PCR擴(kuò)增曲線

Figure 3 The dissociation curves of real-time quantitative PCR圖3 qRT-PCR溶解曲線

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表達(dá)變化比較（△Ct,±s）

Table 2 Comparison of expression changes of CDK8 and CKS2 genes before and afterstimulation表2 胃泌素刺激前后基因CDK8、CKS2表達(dá)變化比較（△Ct,±s）

＊P＜0.05

組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組t n33 CDK8 10.35±0.37 11.60±0.59 3.129＊CKS2 4.59±0.43 5.76±0.51 3.053＊

3 討論

3.1 胃泌素誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位使得基因CDK8和CKS2發(fā)生差異表達(dá) 翟惠虹等[1]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中胃泌素可刺激主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中的CacyBP/SIP蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，這種核轉(zhuǎn)位具有Ca2+濃度依賴現(xiàn)象，同時(shí)伴有蛋白磷酸化現(xiàn)象。蛋白在細(xì)胞中表達(dá)定位與其生物學(xué)功能密切相關(guān)，CacyBP/SIP在胃泌素刺激下發(fā)生核轉(zhuǎn)位和磷酸化，提示其可能作為信號(hào)分子傳遞信息從而參與細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。為明確在生理?xiàng)l件下CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位是否會(huì)有相同差異表達(dá)基因，本研究選擇用胃泌素作為刺激因子，誘導(dǎo)CacyBP/SIP入核,結(jié)果顯示胃泌素誘導(dǎo) Ca?cyBP/SIP入核后基因CDK8、CKS2表達(dá)上調(diào)，這與PCR芯片結(jié)果一致,說(shuō)明在胞核中CacyBP/SIP過(guò)表達(dá)情況下篩選出差異基因表達(dá)趨勢(shì)同胃泌素誘導(dǎo)CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后結(jié)果一致。

3.2 CDK8和結(jié)腸癌的關(guān)系 Firestein等[4]研究發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)結(jié)腸癌細(xì)胞中CDK8轉(zhuǎn)錄水平對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控發(fā)揮重要作用，因而被提議為早期致癌基因。Firestein等[5]還發(fā)現(xiàn)CDK8參與由βcatenin介導(dǎo)的原癌基因激活。He等[6]發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中，CDK8表達(dá)量降低后通過(guò)降低β-catenin表達(dá)及阻滯細(xì)胞G0/G1期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明CDK8通過(guò)影響β-catenin的表達(dá)量進(jìn)而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)。

3.3 CKS2與結(jié)腸癌的關(guān)系 基因CKS2是CKS家族成員之一，可催化亞基結(jié)合形成復(fù)合物。過(guò)表達(dá)的CKS2在細(xì)胞應(yīng)激情況下阻斷DNA復(fù)制的S期內(nèi)檢查點(diǎn)，使DNA持續(xù)性復(fù)制進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[7]。CKS2在細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中具有非常重要的作用，是生殖細(xì)胞從減數(shù)第1次分裂中期到后期的必要條件[8]。研究發(fā)現(xiàn)在膀胱癌[9]、食管癌[10]、胃癌[11]、膽管癌[12]等惡性腫瘤中CKS2均呈高表達(dá)，且與腫瘤的侵襲性和預(yù)后不良密切相關(guān)，進(jìn)而有望成為一種新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物。與正常組織、癌旁組織相比較，CKS2在結(jié)腸癌中也呈現(xiàn)高表達(dá)[13]。

3.4 CacyBP/SIP與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系 在不同腫瘤細(xì)胞中CacyBP/SIP發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，在腎癌細(xì)胞中其可能通過(guò)降低β-catenin表達(dá)量使CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而阻礙細(xì)胞周期的進(jìn)展[14]；在胰腺癌細(xì)胞中其通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換進(jìn)而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[15]；在胃癌細(xì)胞中CacyBP/SIP可通過(guò)對(duì)β-catenin表達(dá)和T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（Tcf/LEF）轉(zhuǎn)錄激活的影響進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖[16]。以上研究表明CacyBP/SIP在腫瘤細(xì)胞中大多數(shù)是通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控及β-catenin活動(dòng)調(diào)節(jié)而參與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)的。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)胃泌素可刺激CacyBP/SIP發(fā)生核轉(zhuǎn)位；同時(shí)也證明在CacyBP/SIP過(guò)表達(dá)情況下完成的細(xì)胞周期PCR芯片所篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因同生理?xiàng)l件下CacyBP/SIP核轉(zhuǎn)位后的差異表達(dá)基因一致，對(duì)篩選出來(lái)的差異表達(dá)基因與CacyBP/SIP的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。

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