四川省茂縣花椒根結(jié)線蟲病病原鑒定

王曦茁， 汪來發(fā)＊， 楊佐忠， 劉子雄， 余明忠

（1．中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)與保護(hù)研究所，國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2．四川省森林病蟲害防治檢疫站，成都 610081；3．四川省茂縣林業(yè)局，茂縣 623200）

花椒（Zanthoxyl u m bungeanu m Maxi m）為蕓香科花椒屬落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)于我國，是重要的木本油料和香料樹種，因適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣和收益大，深受群眾歡迎［1］。我國自1999年實(shí)行退耕還林工程以來，四川省在退耕地大力種植花椒，目前已成為許多地區(qū)農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)和高半山農(nóng)民增收致富的主要途徑之一。2005年以來，四川阿壩州茂縣部分鄉(xiāng)鎮(zhèn)的花椒幼樹植株矮小，葉片發(fā)黃、失綠，生長緩慢，最后植株枯死，嚴(yán)重地塊死亡率達(dá)到30%～50%?；ń犯案馓幮纬稍S多小米粒或綠豆粒大小形狀不規(guī)則的根結(jié)，隨后側(cè)根也出現(xiàn)大小不等、表面粗糙的形狀不規(guī)則根結(jié)，表面為褐色至深褐色，根結(jié)表面又長出許多細(xì)的分枝須根，單株根結(jié)有的多達(dá)百個以上，主要分布在0～30 c m土層。剖開根結(jié)見有白色梨形雌蟲，即花椒樹感染了根結(jié)線蟲。我國學(xué)者雖對花椒病害進(jìn)行了廣泛的研究［2］，僅有一位學(xué)者提及花椒苗感染南方根結(jié)線蟲［Mel oidogyne incognita （Kof oid ＆ White）Chit wood］［3］，至今未見花椒根結(jié)線蟲病的詳細(xì)報(bào)道。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，作為茂縣的支柱產(chǎn)業(yè)，茂縣的花椒栽植面積在不斷擴(kuò)大，根結(jié)線蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失也在逐年增加，為了明確茂縣花椒根結(jié)線蟲病的病原種類，在2011年4月－9月間，筆者采集四川茂縣影響嚴(yán)重的花椒根結(jié)線蟲樣品，通過花椒根結(jié)線蟲形態(tài)觀察測量、雌成蟲會陰花紋、同工酶的酯酶譜帶特征和分子生物學(xué)特征分析，明確了該縣花椒根結(jié)線蟲病的病原種類，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 花椒根結(jié)線蟲的采集

在四川省茂縣白溪鄉(xiāng)和疊溪鎮(zhèn)花椒種植區(qū)采集感病花椒樣品，使用隨機(jī)取樣法，采集長有根結(jié)的根及其周圍的病土，病土采自土壤表層5～30 c m處，每個地塊隨機(jī)采5個點(diǎn)，混勻后放入同一個采集袋內(nèi)，做好標(biāo)記。將采集的標(biāo)樣帶回實(shí)驗(yàn)室，以單卵塊接種在滅菌土中培養(yǎng)的剛長出兩片真葉的易感病番茄幼苗的土中，培養(yǎng)2個月，用于后期鑒定［4］。

1．2 花椒根結(jié)線蟲的獲得

雌蟲的分離和收集：單卵塊繁殖60 d后，取被侵染的番茄根，在體視顯微鏡下將根結(jié)表皮用鑷子或針尖輕輕撥開，剖面上乳白色的光滑球狀物即為根結(jié)線蟲的雌蟲，用解剖針輕輕撥出，放入水中待用。

2齡幼蟲的收集：單卵塊繁殖60 d后，采集被侵染的番茄根清水洗凈，剪成3 c m小段，裝入500 mL三角瓶中，配制體積分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉溶液，在上述三角瓶中倒入200～300 mL次氯酸鈉溶液，封口后猛搖3 min，立即用蒸餾水沖洗數(shù)次，先后過200目和500目篩，用蒸餾水反復(fù)沖洗留在500目篩子上的卵，最后用無菌水沖洗收集于無菌的小燒杯中。將上述卵放于26℃無菌培養(yǎng)箱中孵化3 d，得到根結(jié)線蟲的2齡幼蟲。

1．3 形態(tài)學(xué)鑒定

1．3．1 雌蟲主要形態(tài)特征觀察測量

觀察頭部特征、口針特征等。測量20條線蟲體長、最大體寬、口針長和DEGO（背食道腺開口至口針基部球的距離）等形態(tài)指標(biāo)。

1．3．2 2齡幼蟲主要形態(tài)特征觀察測量

觀察頭部特征、尾部特征等。共觀測20條線蟲。主要測計(jì)的指標(biāo)為體長、最大體寬、口針長、DEGO和尾長。

1．3．3 雌蟲會陰花紋的制作和觀察

在體視顯微鏡下解剖根結(jié)，挑取成熟雌蟲20條。將雌蟲移入硬塑料板上的一滴體積分?jǐn)?shù)45%乳酸中，用解剖刀切取下尾端（蟲體后部約1／4處），將尾端的體內(nèi)組織去掉，切除尾端表皮多余的部分，僅留下會陰花紋部分。將會陰花紋轉(zhuǎn)移至一塊載玻片上的純甘油滴中，一個玻片上放10塊會陰花紋，以AFG液為浮載劑，用樹脂封片，制成永久玻片。在顯微鏡下觀察會陰花紋的形態(tài)特征并拍照。

1．4 同工酶分析

取5μL浸提液（20%蔗糖＋2%Triton X－100）移至自制研磨管中，解剖鏡下分離一個剛開始產(chǎn)卵的雌蟲，轉(zhuǎn)入管內(nèi)浸提液中，用自制的圓頭磨面小玻璃棒充分研磨，補(bǔ)加10μL浸提液。至－20℃冷凍保存。參考Esbenshade和Triantaphyllou等的方法應(yīng)用垂直板聚丙烯凝膠電泳做酯酶分析［5］。聚丙烯酰胺濃度分別為2．5%和7．5%。凝膠板大小為150 mm×120 mm，凝膠厚度1．5 mm，電極緩沖液是p H 8．3的Tris－鹽酸緩沖液。每孔加樣量為20μL（含濃度為1 mg／mL溴酚藍(lán)溶液），電泳前30 min電壓設(shè)在80 V，之后將其穩(wěn)定在190 V，電泳進(jìn)行約2 h，直到溴酚藍(lán)指示條帶遷移距離達(dá)到10 c m。酯酶染色參照胡凱基方法［6］。顯色完全后蒸餾水漂洗3次，在固定液（10%醋酸＋10%甘油）中固定3 h以上，酯酶表型的命名參照Esbenshade和Triantaphyllou等［5］的標(biāo)準(zhǔn)，以已鑒定的北方根結(jié)線蟲（M．hapl a）樣本（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賈克功教授提供）作為參照系判讀酯酶譜型，初步確定根結(jié)線蟲的種類，每個樣品做3個重復(fù)。

1．5 分子生物學(xué)鑒定

1．5．1 根結(jié)線蟲DNA提取

在解剖鏡下從組織內(nèi)挑取1頭雌蟲置于載玻片上，無菌水沖洗3次，滴10μL預(yù)冷的線蟲裂解液（10 mmol／L Tris－HCl p H 8．0，1 mmol／L EDTA p H 8．0，0．25 mol／L NaCl，1%SDS）在蟲體上，用槍頭壓碎后從載玻片上吸取盡可能多含線蟲物質(zhì)的裂解液放入預(yù)先裝有10μL無菌水的離心管中，加入2μL的1 mg／mL蛋白酶K并快速加入液氮中冷凍10 min，65℃水浴1 h，95℃水浴10 min使蛋白酶K變性，產(chǎn)物直接用于PCR擴(kuò)增或者－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5．2 PCR擴(kuò)增

r DNA－ITS區(qū)擴(kuò)增采用的通用引物為V5367（5′－TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT－3′）和26S（5′－TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG－3′）［7］；r DNA－IGS區(qū)擴(kuò)增采用的通用引物為5S（5′－TTA ACT TGC CAG ATC GGA CG－3′）和18S（5′－TCT AAT GAG CCG TAC GC－3′）［8］。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成。

PCR體系（25μL）包括模板DNA 4μL，10×PCR buffer（Mg2＋）2．5μL，d NTPs（2．5 mmol／L）2μL，上 游 引 物 （10μmol／L）1μL，下 游 引 物（10μmol／L）1μL，Taq DNA 聚 合 酶 （5 U／μL）0．2μL，加 H2O至25μL。r DNA－ITS區(qū)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。IGS區(qū)反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃30 s，53℃30 s，72℃90 s，循環(huán)45次；72℃延伸10 min，4℃保存。取5μL PCR產(chǎn)物采用1．2%瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min進(jìn)行檢測。

1．5．3 PCR產(chǎn)物的回收

PCR產(chǎn)物由DNA膠回收試劑盒（Ta Ka Ra）回收、純化，具體操作步驟參照試劑盒操作說明。

1．5．4 PCR產(chǎn)物的克隆、測序及數(shù)據(jù)分析

將純化后的PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒載體p MD18－T（Ta Ka Ra）上，選取每種群各3個陽性克隆由Invitrogen公司測序。利用NCBI BLAST工具和DNA MAN 5．0軟件，將獲得的r DNA－ITS區(qū)和r DNA－IGS區(qū)序列與Gen Bank已登錄的根結(jié)線蟲序列進(jìn)行比對分析。利用Mega5．0軟件通過最大似然法（maxi mu m likelihood）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用Ki mura t wo－parameter模型。同時對構(gòu)建的系統(tǒng)樹作自展檢驗(yàn)（bootstrap test）以獲得分支的支持率，自展檢驗(yàn)中重復(fù)抽樣次數(shù)為1000次，以秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）（X03680）的ITS和IGS序列作為外群。

2 結(jié)果與分析

2．1 根結(jié)線蟲形態(tài)學(xué)鑒定

雌蟲：體白色，梨形，頸短，頭區(qū)大，無環(huán)紋，口針纖細(xì)，基球圓形和桿部有明顯界線。錐部向背部稍稍彎曲，桿部末端最寬。

2齡幼蟲：蠕蟲狀，頭不突出，無縊縮，口針基部球圓形。尾部有明顯透明區(qū)，尖端狹窄。

通過對會陰花紋觀察，會陰花紋為近圓的六邊形到卵圓形，背弓扁平或波浪形，側(cè)線不明顯，線紋平滑到波浪形，尾端區(qū)通常有刻點(diǎn)（圖1）。

雌蟲和2齡幼蟲的部分測量值見表1。參照文獻(xiàn)［9－10］，初步確定花椒根結(jié)線蟲為北方根結(jié)線蟲（M．hapl a）。

圖1 花椒根結(jié)線蟲的會陰花紋Fig．1 The perineal patter n of the pepper root－knot nematode

表1 花椒根結(jié)線蟲雌蟲和2齡幼蟲的測量值1）Table 1 Measurementof females and second－stage juveniles of the pepper root－knot nematode

2．2 酯酶同工酶酶譜

將分離純化的根結(jié)線蟲種群進(jìn)行同工酶分析，電泳結(jié)果顯示分離純化的種群根結(jié)線蟲雌成蟲的酯酶同工酶譜均出現(xiàn)一條酯酶帶，酯酶譜帶類型為H1，遷移率為0．5（圖2），這與已知的北方根結(jié)線蟲酯酶同工酶譜相同［5］，因此可以斷定侵染花椒的根結(jié)線蟲為北方根結(jié)線蟲單一種群（M．hapl a）。

2．3 分子生物學(xué)特征

2．3．1 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒DNA酶切鑒定

通過通用引物對花椒根結(jié)線蟲的r DNA－ITS區(qū)和r DNA－IGS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段長度在770 bp左右（圖3），同北方根結(jié)線蟲的序列長度基本一致。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后都得到1個目的片段大小相似的片段（圖3），這說明質(zhì)粒為目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的重組克隆。

圖2 花椒根結(jié)線蟲酯酶電泳譜型Fig．2 Phenotype of ester ase isozy me（Est）of the pepper root－knot nematode

圖3 花椒根結(jié)線蟲ITS區(qū)和IGS區(qū)的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig．3 The PCR identification results of the pepper root－knot nematode ITS and IGS fr agments

2．3．2 序列分析及同源性結(jié)果比較

測序結(jié)果表明，r DNA－ITS區(qū)目的片段長度為768 bp，其 中 ITS1－5．8S－ITS2 區(qū) 序 列 長 度 為477 bp，在Gen Bank中進(jìn)行BLAST和DNA MAN 6．0比對分析，發(fā)現(xiàn)ITS1－5．8S－ITS2區(qū)序列與北方根結(jié)線蟲（AY268108、AY281854和JX024147）序列只有1個堿基差異，序列相似性為99．79%；r DNAIGS區(qū)目的片段長度為768 bp，其中IGS2區(qū)序列長度為562 bp，與在美國分離獲得北方根結(jié)線蟲HI種群（AY528418）只有2個堿基差異，序列相似性為99．64%。將本研究中獲得ITS和IGS序列與Gen－Bank中下載的已知根結(jié)線蟲序列進(jìn)行比對分析，用Maxi mu m likelihood法分別構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹：圖4為基于ITS序列構(gòu)建的根結(jié)線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹，花椒根結(jié)線蟲與北方根結(jié)線蟲位于同一大分支，支持率為98%，從樹的分支狀況來看，4種根結(jié)線蟲可分為兩組，第Ⅰ組包括所有的北方根結(jié)線蟲，第Ⅱ組包括南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。組間相隔較遠(yuǎn)，分支間的支持率大于98%，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較清晰。圖5為基于IGS序列構(gòu)建的根結(jié)線蟲系統(tǒng)發(fā)育樹，花椒根結(jié)線蟲與北方根結(jié)線蟲位于同一大分支，支持率為98%；與基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹相對應(yīng)，常見的4種根結(jié)線蟲也可分為兩組：第Ⅰ組包括所有的北方根結(jié)線蟲，而其他3種根結(jié)線蟲全部位于Ⅱ組，組間相隔較遠(yuǎn)，兩個大分支間支持率大于98%，北方根結(jié)線蟲所在分支與南方根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲形成的分支間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系清晰，說明花椒根結(jié)線蟲為北方根結(jié)線蟲。

3 結(jié)論與討論

由于寄主和環(huán)境等因素的影響，根結(jié)線蟲種內(nèi)和種間的形態(tài)常常有較大的變化，因此，單純依賴一種方法鑒定很難做到快速、準(zhǔn)確。應(yīng)用r DNA－ITS和r RNA－IGS克隆、序列測定分析及比對，已成功地應(yīng)用于根結(jié)線蟲的鑒定［11－12］。本文根據(jù)花椒根結(jié)線蟲雌蟲和2齡幼蟲的形態(tài)特征及雌成蟲的會陰花紋，雌蟲酯酶同工酶分析及分子生物學(xué)的檢測（r DNA－ITS區(qū)和r RNA－IGS區(qū)），結(jié)果表明四川茂縣地區(qū)花椒根結(jié)線蟲的病原為北方根結(jié)線蟲。在鑒定中，采用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)特征分析進(jìn)行綜合鑒定的方法，從而避免了用一種方法鑒定可能出現(xiàn)的誤差。這是首次報(bào)道北方根結(jié)線蟲引起的花椒新病害，同時也是首次報(bào)道北方根結(jié)線蟲在我國四川省的分布。

近些年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，花椒根結(jié)線蟲病的發(fā)生在逐步擴(kuò)展，但因?yàn)槠湮：哂须[蔽性，還未被關(guān)注和引起足夠重視。茂縣位于四川省西北部，阿壩藏族羌族自治州的東南緣，是岷江上游的高山峽谷地帶。許多花椒栽植在退耕地及半高山坡上，海拔在1 500～2 000 m，冬冷夏涼、晝夜溫差大、7月平均溫度20．9℃，低于北方根結(jié)線蟲分布南限溫度（7月份平均溫度為26．7℃）［13］，因此在這樣的生態(tài)環(huán)境下，北方根結(jié)線蟲是可以生存的。在以前的報(bào)道中，四川省危害植物的根結(jié)線蟲為常見的南方根結(jié)線蟲（M．incognita）、爪哇根結(jié)線蟲（M．j avanica）和花生根結(jié)線蟲（M．a(chǎn)renaria）等［14］，未見北方根結(jié)線蟲的報(bào)道，北方根結(jié)線蟲是由于苗木運(yùn)輸傳進(jìn)四川，還是原已存在，還有待進(jìn)一步的研究。

圖4 根結(jié)線蟲不同種群ITS序列的聚類分析（NJ）Fig．4 NJ tree of 16 Meloidogyne isolates based on ITS sequences of M．hapla

圖5 根結(jié)線蟲不同種群IGS序列的聚類分析（Maxi mum likelihood）Fig．5 Maxi mu m likelihood tree of 12 Meloidogyne isolates based on IGS sequences

根據(jù)根結(jié)線蟲病害發(fā)生和流行的特點(diǎn)，目前花椒根結(jié)線蟲病的發(fā)生范圍仍很有限，建議建立無病種苗生產(chǎn)基地和進(jìn)行植物檢疫，發(fā)病區(qū)內(nèi)種苗不得運(yùn)輸或攜帶到非發(fā)病區(qū)種植；選用無病地塊的健壯、無病種苗；對已感病的苗木實(shí)行就地銷毀；清除植株病殘?bào)w及附近雜草，控制該病的擴(kuò)展蔓延。

［1］ 曾京京．我國花椒的栽培起源和地理分布［J］．中國農(nóng)史，2000，19（4）：68－75．

［2］ 李篤肇．花椒苗根結(jié)線蟲病的發(fā)生與防治［J］．特種經(jīng)濟(jì)動植物，2004（12）：33．

［3］ 張炳炎．花椒病蟲害診斷與防治原色圖譜［M］．北京：金盾出版社，2006：1－191．

［4］ 汪來發(fā)，楊寶君，李傳道．華東地區(qū)根結(jié)線蟲的調(diào)查［J］．林業(yè)科學(xué)研究，2001，14（5）：484－489．

［5］ Esbenshade P R，Triantaphyllou H H．Use of enzy me phenotypes for identification of Meloidogyne species（Nematoda：Tylenchida）［J］．Jour nal of Nematology，1985，17：6－20．

［6］ 胡凱基．酯酶在根結(jié)線蟲分類上應(yīng)用的研究［J］．林業(yè)科學(xué)研究，1988（6）：650－656．

［7］ Vrain T C，Wakarchuk D A，Levesque A C，et al．Intraspecific r DNA restriction frag ment length poly morphism in the Xiphinema a mericanu m gr oup ［J］．Funda mental and Applied Nematology，1992，15（6）：563－573．

［8］ Vahidi H，Curran J，Nelson D W，et al．Unusual sequences，ho mologous to 5S RNA，in riboso mal DNA repeats of the ne matode Meloidogyne arenaria［J］．Journal of Molecular Evol u－tion，1988，27：222－227．

［9］ 艾森拜克J D，赫什曼 H，薩塞J N，等．四種最常見根結(jié)線蟲分類指南（附圖檢索）［M］．楊寶君譯．昆明：云南人民出版社，1986：17－28．

［10］謝輝．植物線蟲分類學(xué)［M］．第2版．北京：高等教育出版社，2005：243－247．

［11］Blok V C，Phillips M S，F(xiàn)ar gette M J．Intergenic region of Meloidogyne mayaguensis and other major tropical root－knot nematodes［J］．Jour nal of Nematology，1997，29（1）：16－22．

［12］萬新龍，李健洪，彭德良．根結(jié)線蟲r DNA－ITS片段的克隆與序列分析［J］．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，05（26）：624－628．

［13］泰勒A L，薩塞J N．植物根結(jié)線蟲［M］．楊寶君，曾大鵬，譯．北京：科學(xué)出版社，1983：67－121．

［14］李篤肇，鄭志平，李清澤．四川省植物病原根結(jié)線蟲種的記述［J］．西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1986（4）：19－21．