三七總皂苷對(duì)大鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李全輝 紀(jì)志鵬 葛運(yùn)飛 丁印魯 山東大學(xué)第二醫(yī)院普外科 濟(jì)南 250033

肝臟缺血再灌注（HIR）是普外科臨床常見的創(chuàng)傷后及肝臟手術(shù)后的病理生理過程，可導(dǎo)致嚴(yán)重的肝臟損傷，其具體損傷機(jī)制可能與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等途徑有關(guān)[1-4]。三七，又名田七，是五加科人參屬草本植物，其主要藥理活性成分為三七總皂苷（panaxnonginsengsaponins，PNS），研究[5]表明其在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等組織器官缺血再灌注損傷或其他損傷中均具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用。本研究利用大鼠肝缺血再灌注損傷模型，觀察氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)指標(biāo)變化，探討三七總皂苷對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性Spraque Dawley大鼠30只，體質(zhì)量250～300g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)合格證號(hào)：SCXK（魯）20030004。術(shù)前予以自由進(jìn)食飲水、恒溫恒濕等規(guī)范化飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 三七總皂苷（粉劑，純度99%，純昆明植物研究所），MDA、SOD檢測(cè)試劑盒（南京凱基生物公司），MPO、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、ELISA 檢測(cè)試劑盒（武漢博士德公司）。

1.3 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制備 30只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、肝缺血再灌注組（HIR組）和三七總皂苷治療組（PNS組），每組10只。三組均于術(shù)前禁食12h，戊巴比妥鈉30mg/kg腹腔注射麻醉，參照Pringle法[6]構(gòu)建肝缺血再灌注模型，Sham組僅暴露肝動(dòng)脈、門靜脈、膽管等肝門結(jié)構(gòu)但不夾閉阻斷，術(shù)后120min處死；HIR組及PNS組則夾閉肝門結(jié)構(gòu)30min，開放再灌注180min后處死。PNS組術(shù)前1h予50mg/kg的PNS生理鹽水溶液（濃度5mg/mL）腹腔注射，Sham組及HIR組則均于術(shù)前1h給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。預(yù)處理3h后處死大鼠。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) ①丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定：應(yīng)用比色法測(cè)定大鼠缺血再灌注損傷后肝組織MDA含量以確定脂質(zhì)過氧化水平，進(jìn)而評(píng)估氧化應(yīng)激水平。MDA在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）反應(yīng)生成紅棕色的三甲川（3，5，5-三甲基惡唑-2，4二酮），最大吸收波長532nm。取大鼠肝臟組織100mg加入2mL PPS 50mmol/L液制成勻漿，超聲粉碎10s×3次，根據(jù)MDA檢測(cè)試劑盒說明操作，于分光光度計(jì)中計(jì)算MDA濃度。②超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測(cè)：肝組織勻漿SOD活性應(yīng)用專用試劑盒測(cè)定，SOD活性單位以引起50%O2-歧化的酶含量表示。③髓過氧化物酶（MPO）檢測(cè)：前述肝組織勻漿，應(yīng)用MPO檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，1U的MPO活力以25℃時(shí)1min分解H2O21mmol表示（U/g）。④炎癥相關(guān)因子測(cè)定：血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）及肝組織中細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）含量均應(yīng)用ELISA法檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，將檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，予單因素方差分析，其中方差齊性者，組間行SNK檢驗(yàn)，方差不齊者，組間行Dunnett’s T3檢驗(yàn)，P＜0.05顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 三組氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)比較 肝缺血再灌注損傷組（HIR組）MDA水平較假手術(shù)組（Sham組）明顯升高（P＜0.05），而 SOD 活性則明顯下降（P＜0.05），三七總皂苷治療組（PNS組）MDA水平較HIR組明顯下降（P＜0.05），且 SOD 活性明顯上升（P＜0.05），但與Sham組比較差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.2 三組炎癥相關(guān)指標(biāo)比較 HIR組肝組織中MPO活性、ICAM-1及血清TNF-α、IL-1β含量均較Sham組明顯升高（P＜0.05）,而PNS組肝組織中MPO活性、ICAM-1及血清TNF-α、IL-1β含量雖較Sham組有顯著升高（P＜0.05），但較HIR組明顯下降（P＜0.05），見表 2、圖 2～3。

表1 三組大鼠肝組織氧化應(yīng)激及內(nèi)源性抗氧化指標(biāo)比較

圖1 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后肝組織MDA及SOD變化注：Sham組：假手術(shù)組；H IR組：肝缺血再灌注損傷組；PNS組：三七總皂苷治療組；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

表2 三組大鼠肝組織及血清炎癥相關(guān)指標(biāo)比較

圖2 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后肝組織MPO、ICAM-1變化注：Sham組：假手術(shù)組；HIR組：肝缺血再灌注損傷組；PNS組：三七總皂苷治療組

3 討 論

圖3 三組大鼠肝缺血再灌注損傷后

肝臟缺血再灌注損傷可以導(dǎo)致不同程度肝細(xì)胞腫脹、空泡變性，是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，常見于肝臟外科手術(shù)、肝移植手術(shù)、低血容量性休克、肝靜脈閉塞病、Budd-Chiari綜合征等疾病及移植前的器官冷保存[7-9]。肝臟缺血再灌注損傷可導(dǎo)致肝代謝、解毒功能降低、循環(huán)阻力升高，乃至肝功能衰竭，進(jìn)而影響患者預(yù)后。多種機(jī)制參與肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展過程，自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致肝臟氧化及抗氧化調(diào)節(jié)失去平衡，是肝臟缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。已有研究表明，丙二醛（MDA）是生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，其含量水平可間接顯示氧自由基對(duì)于機(jī)體細(xì)胞受攻擊的程度[10]，而超氧化物歧化酶（SOD）活性則反映了體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化體系的功能，其可催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，平衡體內(nèi)氧自由基[11]。本研究表明缺血再灌注后肝組織MDA水平明顯升高（P＜0.05），內(nèi)源性SOD活性則明顯下降（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了氧化應(yīng)激及內(nèi)源性抗氧化體系失衡在缺血再灌注肝組織損傷中起重要作用，而PNS治療后，雖然無法完全扭轉(zhuǎn)這一失衡的趨勢(shì)，但可以一定程度上減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激及內(nèi)源性抗氧化體系不平衡程度，進(jìn)而表明，PNS可以通過減輕氧自由基損傷并改善內(nèi)源性抗氧化體系功能來減輕肝組織缺血再灌注損傷。

此外，多種炎癥相關(guān)因子的釋放也參與了肝缺血再灌注損傷的病理生理過程。研究表明肝缺血再灌注損傷過程中導(dǎo)致缺血組織中性粒細(xì)胞黏附及遷移。在與內(nèi)皮細(xì)胞交互作用下，結(jié)合黏附分子，中性粒細(xì)胞聚集可導(dǎo)致肝血竇阻塞、細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放、Kuffer細(xì)胞激活等組織變化，進(jìn)而引發(fā)肝組織損傷[12]。髓過氧化物酶（MPO）是中性粒細(xì)胞組織浸潤程度的指標(biāo)，已有研究及本實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，缺血再灌注后肝組織MPO活性明顯升高。ICAM-1參與中性粒細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間黏附，是重要的黏附因子。TNF-α來源于巨噬細(xì)胞分泌，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞在組織中的浸潤，是重要的炎癥介質(zhì)。而IL-1β作為另一重要的致炎細(xì)胞因子可以誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分泌炎癥相關(guān)蛋白酶（如MMP），并激活T細(xì)胞，參與組織炎癥過程。TNF-α與IL-1β可以刺激組織ICAM-1表達(dá)，進(jìn)而增加中性粒細(xì)胞浸潤，加重組織損傷。本研究選取TNF-α、IL-1β、ICAM-1 作為 HIR 后炎癥反應(yīng)的主要指標(biāo)，也證實(shí)缺血再灌注后肝組織TNF-α、IL-1β、ICAM-1均有不同程度升高，進(jìn)而表明炎癥反應(yīng)與肝組織參缺血再灌注損傷的過程，與已有相關(guān)研究報(bào)道相符[2，12-14]。

三七總皂苷（PNS）為傳統(tǒng)中藥三七的主要活性成分，研究[5]證實(shí)，其在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等組織器官中具有多種生理作用，具體藥理機(jī)制與改善缺氧、降血糖、降血脂、改善微循環(huán)、抗氧化、抗炎、抗衰老等相關(guān)。研究[5]也表明，抗氧自由基損傷、減輕鈣超載、抗炎等途徑是其減輕肝組織缺血再灌注損傷的主要方式。本研究顯示PNS治療可以明顯降低缺血再灌注后肝組織中MDA水平、MPO活性、ICAM-1含量及血清TNF-α、IL-1β，并明顯升高SOD活性（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PNS可以通過抑制脂質(zhì)過氧化并增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化體系功能而減少肝缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷，也可通過影響炎癥介質(zhì)釋放及中性粒細(xì)胞浸潤而減輕HIR損傷。

綜上所述，三七總皂苷可以通過減少氧化應(yīng)激水平以及炎癥因子表達(dá)進(jìn)而減輕肝缺血再灌注損傷，起肝臟保護(hù)作用，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。

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