特異性蛋白酶酶解蝦副產(chǎn)物制備ACE抑制肽

左 琦，吳秉宇，張建華，錢(qián)炳俊

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

特異性蛋白酶酶解蝦副產(chǎn)物制備ACE抑制肽

左 琦，吳秉宇，張建華*，錢(qián)炳俊

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240）

ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系（QSAR）的研究認(rèn)為小肽C末端氨基酸的疏水性和其ACE抑制活性之間呈正相關(guān)關(guān)系。針對(duì)性地選擇胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶兩步酶解蝦副產(chǎn)物制備ACE抑制肽。在一定溫度、pH和加酶量條件下，以蛋白質(zhì)的水解度和ACE抑制率為指標(biāo)，確定胰凝乳蛋白酶、脯氨酸蛋白酶的最佳酶解時(shí)間均為4h。兩步酶解產(chǎn)物ACE抑制的IC50值為1.645mg protein/mL。經(jīng)透析后，得到0～500u（組分1）和500～1000u（組分2）兩個(gè)組分，組分1和組分2的IC50值分別降為0.333mg peptide/mL和1.320mg peptide/mL。質(zhì)譜分析結(jié)果表明組分1中含有10個(gè)肽，分別由5～14個(gè)氨基酸組成；組分2中含有15個(gè)肽，分別由7～14個(gè)氨基酸組成。25個(gè)已知序列多肽中有22個(gè)多肽的羧基端是脯氨酸或芳香族氨基酸，與預(yù)期相符。

α-胰凝乳蛋白酶，脯氨酸蛋白酶，蝦副產(chǎn)物，ACE抑制肽

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）在血壓調(diào)節(jié)中有至關(guān)重要的作用，它能將沒(méi)有活性的血管緊張素I（Asp-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu）C末端的二肽裂解，使其轉(zhuǎn)換為能促使血壓升高的血管緊張素Ⅱ（Asp-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe）[1]。因此，抑制ACE的活性將能降低血壓。

ACE抑制肽構(gòu)效關(guān)系（QSAR）的研究認(rèn)為，ACE抑制肽的C端氨基酸是與ACE活性部位結(jié)合的關(guān)鍵，C末端氨基酸的疏水性和小肽的ACE抑制活性之間正相關(guān)[2]。C末端氨基酸為具環(huán)狀結(jié)構(gòu)的芳香族氨基酸（包括色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸）或脯氨酸的ACE抑制肽，其活性一般較強(qiáng)[3]，如Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro[4]。

目前廣泛用于治療高血壓的肽類(lèi)藥物，如卡托普利（Captopril）和賴(lài)諾普利（Lasinopril）都是C末端氨基酸為脯氨酸的肽，但都是化學(xué)合成品，雖然具有很好的降壓效果，但是會(huì)引發(fā)皮膚病、咳嗽、腎功能衰竭等副作用[5]。近年來(lái)，有從乳清[6]、魚(yú)[7]、雞肉組織[8]和雞蛋[8]等食物原料中分離得到ACE抑制肽的報(bào)道，尋找毒副作用小的食源性ACE抑制肽成為目前的研究熱點(diǎn)。

我國(guó)蝦類(lèi)資源極為豐富，蝦仁加工業(yè)比較發(fā)達(dá)，然而蝦仁加工同時(shí)產(chǎn)生的大量蝦頭、蝦殼等副產(chǎn)物卻沒(méi)有得到充分的利用[9]。蝦副產(chǎn)物中蛋白質(zhì)的比例較高，若能選用合適的酶對(duì)其進(jìn)行酶解，制備ACE抑制肽，將能提高蝦副產(chǎn)物的利用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期國(guó)內(nèi)外對(duì)功能性寡肽構(gòu)效關(guān)系（QSAR）的研究成果，選擇α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶兩種特異性蛋白酶酶解蝦副產(chǎn)物，有望制備得到羧基端為脯氨酸或芳香族氨基酸的ACE抑制肽。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南美白對(duì)蝦 上海海旭水產(chǎn)有限公司；α-胰凝乳蛋白酶 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脯氨酸蛋白酶 帝斯曼（中國(guó)）有限公司；TNBS（三硝基苯磺酸）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、底物（Hippuryl-His-Leu）、肽標(biāo)準(zhǔn)混合物（由Gly-Tyr、Val-Tyr-Val、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe組成） 美國(guó)Sigma公司；CE透析袋 上海新睿生物科技有限公司。

多功能粉碎機(jī) 上海正慧工貿(mào)有限公司；DK-8D三孔電熱恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；恒溫干燥箱 德國(guó)Binder有限公司；UVmini-1240分光光度計(jì) 日本島津儀器有限公司；5415D離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；320 pH計(jì) 美國(guó)梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；納升液相色譜-四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 德國(guó)Bruke Dionex公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料準(zhǔn)備 南美白對(duì)蝦剝皮、去頭，放于恒溫干燥箱中65℃烘干12h，取出粉碎，過(guò)60目篩。

1.2.2 酶解條件 α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶的酶解條件[10-11]如表1所示。

表1 兩種酶的酶解條件Table 1 Hydrolysis conditions ofα-chymotrypsin and proline specific protease

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定和氨基酸分析 稱(chēng)取1.0g樣品，加入12mL硫酸和催化劑（硫酸銅和硫酸鉀），放在FOSS消化爐上，消化1.5h。然后用自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定上清液的蛋白質(zhì)含量[12]。氨基酸分析：氨基酸專(zhuān)用高效液相色譜法[13]。

1.2.4 水解度的測(cè)定 參考Adler-Nissen[14]的方法進(jìn)行改進(jìn)。在試管中加入2.00mL pH8.2的磷酸鹽緩沖液和0.25mL樣品混勻，再加入2.00mL 0.10%TNBS溶液搖勻，50℃水浴中避光反應(yīng)60min后，加入4.00mL（0.10mol/L HCl）終止反應(yīng)，室溫冷卻30min后，于340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用不同濃度的亮氨酸代替樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

水解度的計(jì)算：

式中：hNH2為反應(yīng)后氨基態(tài)氮濃度（mmol/g）；h0為反應(yīng)前氨基態(tài)氮濃度（mmol/g）；htot為每克原料蛋白的肽鍵毫摩爾數(shù)（mmol/g），蝦殼蛋白htot＝8.073（mmol/g）。

1.2.5 ACE抑制率測(cè)定 參考Cushman[15]和Li-Chan[16]的方法進(jìn)行改進(jìn)。以Hippuryl-His-Leu為底物，測(cè)定抑制劑對(duì)ACE的抑制活性。試管中加入ACE（酶活力為0.86U/mL）和抑制劑各15μL，37℃水浴5min，然后加入HHL 75μL，37℃水浴45min后，加入1mol/L HCL終止反應(yīng)。然后加入0.7mL乙酸乙酯萃取、離心（4000r/min，10min），吸取0.5mL乙酸乙酯層于試管中，120℃條件下使乙酸乙酯完全揮發(fā)，最后加入2mL去離子水，渦旋混勻后，228nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值。ACE抑制率計(jì)算公式：

式中：C為ACE與HHL完全反應(yīng)后的吸光度；A為加入抑制劑和ACE的吸光度；B為加滅活A(yù)CE的吸光度。

1.2.6 透析 首先將酶解液裝入截留分子量為1000u的透析袋，放入裝有去離子水的燒杯中；在磁力攪拌條件下透析6h后，換一次水，再透析4h；將燒杯里的溶液收集起來(lái)，得到分子量1000u以下的多肽溶液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，裝入截留分子量為500u的透析袋，最后透析得到分子量500～1000u的多肽溶液和分子量500u以下的多肽溶液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮備用。

1.2.7 多肽含量測(cè)定 根據(jù)Church[17]的方法進(jìn)行改進(jìn)。首先配制50mL OPA溶液：分別加入25mL（100mmol/L）的四硼酸鈉、2.5mL 20%（w/w）的十二烷基硫酸鈉（SDS）、40mg的OPA（溶解在1mL甲醇中）；100μL的β-巰基乙醇，用去離子水定容至50mL。然后取50μL的酶解液與2mL的上述OPA溶液在室溫下反應(yīng)2min于340nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。用不同濃度梯度的肽標(biāo)準(zhǔn)混合物代替酶解液做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式檢測(cè)；檢測(cè)范圍為m/z 100～1000；毛細(xì)管電壓為2800V；樣品孔電壓為20V；

MCP檢測(cè)電壓為2100V；噴霧氣流量為50L/h；脫溶劑氣流量為350L/h；脫溶劑溫度為300℃；離子源溫度為100℃；碰撞能量為25eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 蝦副產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析

凱式定氮測(cè)得蝦副產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量為59.94%± 0.98%，蛋白質(zhì)含量較高，具備制備ACE抑制肽的基本條件。氨基酸分析結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，蝦副產(chǎn)物中，除去酸水解破壞的色氨酸外，脯氨酸和芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）占氨基酸總量的12.28%，從蛋白質(zhì)含量和氨基酸組成兩方面分析，蝦副產(chǎn)物是制備ACE抑制肽好的來(lái)源。

表2 蝦副產(chǎn)物氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of shrimp byproducts

2.2 α-胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶酶解時(shí)間的確定

α-胰凝乳蛋白酶為內(nèi)切酶，可從酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的羧基處切斷肽鍵；脯氨酸特異性蛋白酶則能夠在肽鏈中含有脯氨酸的羧基處切斷肽鍵[10]。蛋白質(zhì)的水解度代表蛋白質(zhì)在酶解過(guò)程中，肽鍵被裂解的程度或百分比。根據(jù)兩種蛋白酶酶解蝦副產(chǎn)物的水解時(shí)間-水解度曲線確定兩種酶的最佳酶解時(shí)間。

測(cè)定水解度的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，胰凝乳蛋白酶的水解結(jié)果如圖2所示。

一般認(rèn)為，1個(gè)亮氨酸分子含有1個(gè)α-氨基，由此可將α-氨基的濃度轉(zhuǎn)化為亮氨酸的濃度，在進(jìn)行酶解液水解度測(cè)定時(shí)就可以根據(jù)圖1得到酶解過(guò)程中產(chǎn)生的α-氨基，從而計(jì)算出相應(yīng)的水解度。

圖1 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Leucine

由圖2可知，在0～30min之內(nèi)，水解度的增加速率很快，這可能是在最初的30min內(nèi)蛋白質(zhì)中可斷裂的肽鍵較多，水解度提高快，而隨著時(shí)間的推移，酶可作用的肽鍵數(shù)目減少，水解速率下降，到4h水解度達(dá)到11%后，水解度保持不變，說(shuō)明此時(shí)蛋白已經(jīng)被完全水解。選擇蛋白的水解終點(diǎn)，可以保證充分水解，便于后續(xù)分離得到小肽。因此，第一步酶解時(shí)間的確定，只需考慮水解充分性的因素，選擇4h時(shí)間點(diǎn)。而第二步酶解時(shí)間的確定，則需要綜合考慮酶解的充分性和ACE抑制率。

圖2 蝦副產(chǎn)物胰凝乳蛋白酶水解曲線Fig.2 Hydrolysis curve of shrimp byproduct by α-chymotrypsin

2.3 兩步酶解產(chǎn)物ACE抑制活性的變化

脯氨酸蛋白酶的水解度和ACE抑制活性的變化如圖3所示。

圖3 脯氨酸蛋白酶水解度曲線和酶解液的ACE抑制活性Fig.3 Degree of hydrolysis and ACE inhibitory activity of proline specific proteases hydrolysate

由圖3可知，在4h水解度達(dá)到4.74%以后，水解度保持不變，說(shuō)明此時(shí)間點(diǎn)是脯氨酸蛋白酶的水解終點(diǎn)。脯氨酸蛋白酶酶解之后，進(jìn)行ACE抑制活性測(cè)定。由圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，ACE抑制率先上升，后下降，最后又上升。中間ACE抑制率的下降，可能是由于本來(lái)有抑制活性的大分子肽被酶解產(chǎn)生了無(wú)ACE抑制作用的小分子肽[18]。而隨著酶解的進(jìn)行，這些肽進(jìn)一步被酶解成分子量更小的肽，其具有較高的ACE抑制率，當(dāng)然，也有可能是肽濃度的增大，使ACE抑制率隨之增大。根據(jù)結(jié)果得知，4h酶解時(shí)間的酶解液ACE抑制率最高，為61.30%，IC50為1.645mg/mL，選擇此時(shí)間點(diǎn)的酶解液來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 透析后不同截留分子量透析液的ACE抑制活性

已有的研究結(jié)果表明，具有ACE抑制活性的肽，一般含有2～12個(gè)氨基酸，即分子量范圍在256～1500u之間[19]。因此，選擇截留分子質(zhì)量1000u和500u的透析袋透析后，可以得到2個(gè)組分：組分1的分子質(zhì)量小于500u，組分2的分子質(zhì)量在500～1000u范圍內(nèi)。由于透析之后，去掉了分子量大于1000u以上的肽，所以要確定透析之后酶解液的肽濃度。測(cè)定肽濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。

圖4 多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of peptide mixture

圖4中所指的肽標(biāo)準(zhǔn)混合物是由Gly-Tyr、Val-Tyr-Val、Tyr-Gly-Gly-Phe-Met、Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu、Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe構(gòu)成的混合物，這5個(gè)肽分別由2～8個(gè)氨基酸組成。用此混合物作為標(biāo)準(zhǔn)底測(cè)定透析液中的肽含量，可以比較精確的定量肽含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線中，肽標(biāo)準(zhǔn)物濃度和吸光度值的相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，線性相關(guān)性較強(qiáng)，可用公式y(tǒng)= 0.1887x-0.0001計(jì)算透析后透析液的肽濃度。

表3 透析產(chǎn)物和不同食物來(lái)源酶解肽的ACE抑制率IC50Table 3 ACE inhibitory peptides derived from different food proteins

由表3可知，未透析前，兩步酶解產(chǎn)物的IC50值為1.645mg protein/mL，經(jīng)過(guò)透析之后：組分1（0～500u）和組分2（500～1000u）的IC50值分別降為0.333mg peptide/ mL和1.320mg peptide/mL，可見(jiàn)透析分離后，IC50值有所下降。尤其是分子量為0～500u的肽，其IC50有較大程度的下降，表明經(jīng)過(guò)透析，去掉了大分子的肽，得到分子量較小的肽，這些肽具有更高的ACE抑制活性。

由表3的對(duì)比可發(fā)現(xiàn)，蝦副產(chǎn)物酶解液經(jīng)過(guò)透析之后，分子量小于500u的透析液，其ACE抑制的IC50值低于以往研究中得到的食源性肽。說(shuō)明蝦副產(chǎn)物經(jīng)過(guò)特異性蛋白酶的兩步酶解，能制得ACE抑制率較高（IC50值低）的肽。

2.5 質(zhì)譜分析結(jié)果

由表4可知，通過(guò)胰凝乳蛋白酶和脯氨酸蛋白酶兩步酶解之后，組分1中含有10個(gè)肽，分別由5～14個(gè)氨基酸組成；組分2中含有15個(gè)肽，分別由7～14個(gè)氨基酸組成。25個(gè)已知序列多肽中只有EGGEL，VVIMTSHGNEQL，MSFQDSNNDGIGDL這3個(gè)多肽的羧基端不是脯氨酸或芳香族氨基酸，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道的ACE抑制性較強(qiáng)肽的羧基端應(yīng)具有的結(jié)構(gòu)相符合。

表4 兩組分中多肽的組成Table 4 Composition of peptides in component 1 and 2

然而，得到的這22個(gè)羧基端是脯氨酸或芳香族氨基酸的肽，除了MIAMFMF、GKHLHTF、CYTEEVF這三個(gè)肽為7肽，其余19個(gè)肽都含有8個(gè)或8個(gè)以上的氨基酸。人體攝入之后，仍有可能被體內(nèi)消化酶酶解。因此有必要模擬人體胃腸道消化，再對(duì)其進(jìn)一步酶解。一方面考察這些肽經(jīng)過(guò)消化酶酶解之后的活性變化，另一方面有望從中分離得到ACE抑制活性更高的肽。

3 結(jié)論

本文用胰凝乳蛋白酶—脯氨酸蛋白酶對(duì)蝦副產(chǎn)物進(jìn)行酶解，通過(guò)透析分離和質(zhì)譜分析證實(shí)得到了一些C末端為芳香族氨基酸或脯氨酸的小分子肽，說(shuō)明該酶解體系有望獲得ACE抑制活性高的肽。但兩步酶解的肽多為七肽以上，因此有必要模擬人體胃腸道消化，再對(duì)這些肽進(jìn)一步酶解，一方面考察這些肽經(jīng)過(guò)消化酶酶解之后的活性變化，另一方面有望從中分離得到ACE抑制活性更高的肽。

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Preparation of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from shrimp byproduct by specific enzyme hydrolysis method

ZUO Qi，WU Bing-yu，ZHANG Jian-hua*，QIAN Bing-jun
（School of Agriculture and Biology，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240，China）

Based on the quantitative structure-activity relationship and predictive models of angiotensin I-converting enzyme（ACE）inhibitory peptide，hydrophobic amino acid residues at C-terminal are positively correlated with ACE inhibitory activity.In order to get more proline and hydrophobic amino acid residues at C terminal，α-chymotrypsin and proline protease were chosen to hydrolyse the shrimp byproducts to produce ACE inhibitory peptides.The hydrolysis times were optimized according to the hydrolysis degree（HD）for α-chymotrypsin，and both HD and ACE-inhibitory activity for proline protease，the results showed that the optimal hydrolysis time for both enzyme were 4 hours.The half maximal inhibitory concentration（IC50）for ACE inhibition of hydrolysate was 1.645mg protein/mL.The hydrolysate was separated into fraction 1（0～500u）and fraction 2（500～1000u）by molecular weight cut-off（MWCO）membrane.The IC50value of fraction 1 and fraction 2 were 0.333mg peptide/mL and 1.320mg peptide/mL，respectively.The peptide mixtures were analyzed by time-of-flight mass spectrometry.Ten peptides，which were consisted of peptides with 5 to 14 amino acid residues，were identified in fraction 1.Fifteen peptides，which were consisted of peptides with 7 to 14 amino acid residues were identified in fraction 2.The C-terminal amino acids of 22 out of the 25 peptides were proline or aromatic amino acid，which was corresponding to QSAR results.

α-chymotrypsin；proline protease；shrimp byproducts；ACE inhibitory peptides

TS201.1

A

1002-0306（2014）10-0181-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.032

2013－09－02 *通訊聯(lián)系人

左琦（1988-），女，碩士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

國(guó)家海洋局海洋公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（201205031-05）。