pH響應(yīng)兩親性殼聚糖衍生物納米膠束制備、表征及對維生素D3的體外釋放研究

黎文建，彭海龍，2，*，熊 華，寧方建，張建飛

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)化學(xué)工程系，江西南昌330031）

pH響應(yīng)兩親性殼聚糖衍生物納米膠束制備、表征及對維生素D3的體外釋放研究

黎文建1，彭海龍1，2，*，熊 華1，寧方建1，張建飛1

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047；2.南昌大學(xué)化學(xué)工程系，江西南昌330031）

以羧甲基殼聚糖、N，N-二甲基十六烷基叔胺以及丙烯酸為原料合成了一種新型的pH響應(yīng)性兩親性納米材料，利用FT-IR對其結(jié)構(gòu)進行了表征。該納米材料在水溶液中能夠自發(fā)形成具有殼-核結(jié)構(gòu)的納米膠束，臨界膠束濃度為95mg/L，不同pH條件下粒徑分布有較大差異，表面Zeta電位均為正。以維生素D3為模型分子，測得其對VD3的包封率達(dá)到57.3%，同時考察了該納米膠束包裹VD3在不同pH條件下的釋放行為，結(jié)果顯示在人工模擬胃液（SGF）中累積釋放量最低（42.1%），人工模擬腸液（SIF）中最高（69.2%）。該納米膠束的pH響應(yīng)性行為表明其適宜作為VD3以及其他食品活性成分的潛在納米生物活性載體。

羧甲基殼聚糖，pH響應(yīng)性，膠束，維生素D3，體外釋放

殼聚糖（chitosan）是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，是地球上總量僅次于纖維素的天然氨基堿性多糖[1]，由于其具有無毒、生物可降解、生物相容性等特性而被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)。然而殼聚糖的pKa為6.5，僅溶于弱酸性環(huán)境，這在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。近年來，許多研究人員對殼聚糖進行化學(xué)改性，拓寬了殼聚糖及其衍生物的應(yīng)用范圍，主要包括烷基化改性、醚化改性、酯化改性和季銨化改性[2-5]。兩親性殼聚糖是通過在殼聚糖的C-2位引入疏水基團、C-6位引入親水基團而形成的殼聚糖衍生物，當(dāng)其在水溶液中的濃度高于臨界膠束濃度（critical micelle concentration）時，通過自主裝機理，能夠自發(fā)形成內(nèi)部疏水、外部親水的具有殼-核結(jié)構(gòu)的納米膠束，該膠束體系能夠?qū)⑹杷钚猿煞职灿诤藘?nèi)，而親水外殼又起到保護和傳輸?shù)淖饔茫@對于解決食品中的一些難溶于水的功能活性成分在人體內(nèi)的傳遞具有重要意義。維生素D3（VD3）是一種脂溶性維生素，主要是通過紫外線照射在皮膚合成的，VD3在控制鈣的吸收、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以及胰島素分泌等方面具有重要作用[6]。然而，VD3幾乎不存在于無脂肪甚至低脂肪等日常飲食中，因此在對于追求零脂肪飲食的今天，很容易造成維生素缺乏癥[7]，為了提高VD3的水溶性，Teng等[8]采用大豆蛋白交聯(lián)羧甲基殼聚糖，該納米粒子避免了化學(xué)有毒交聯(lián)劑的使用，對VD3具有較高包封率，但是由于該納米粒子的尺寸很大程度上取決于乳化劑的用量、溶劑種類等，且難以形成具有特定臨界膠束濃度，在較大稀釋條件下具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的納米粒子。因此，本文采用水溶性羧甲基殼聚糖合成了一種新型的兩親性殼聚糖衍生物納米膠束，以VD3為模型分子，考察了不同pH條件下的體外釋放行為。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

羧甲基殼聚糖（CMCs） 上海晶純試劑有限公司；N，N-二甲基十六烷基叔胺 上海嶅稞實業(yè)有限公司；維生素D3（VD3，99%）、芘（98%） 上海阿拉丁試劑有限公司；過硫酸銨（APS） 北京索萊寶科技有限公司；丙烯酸、環(huán)氧氯丙烷、異丙醇、丙酮、乙醇 天津市大茂試劑廠。

磁力攪拌器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA儀器；SHB-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；熒光分光光度計 日本日立；紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；THZ-82恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司；TGL-16C離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 pH敏感性兩親性殼聚糖衍生物的合成 兩親性殼聚糖衍生物（DCMCs）的合成：10mL移液管移取8.6mL N，N-二甲基十六烷基叔胺于250mL圓底燒瓶中，于磁力攪拌器上攪拌，控制溫度為60℃，慢慢一滴一滴的加入7.5mL的環(huán)氧氯丙烷，密閉反應(yīng)2h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去殘留的環(huán)氧氯丙烷，得到暗黃色蠟狀固體。稱取1.0g CMCs溶解在40mL異丙醇水溶液中（v/v=1∶3），置于250mL圓底燒瓶中于磁力攪拌器上攪拌30min，加熱到50℃，將上述制得的黃色蠟狀固體慢慢加入到CMCs溶液中，50℃密閉反應(yīng)24h，所得液體產(chǎn)物用一定量的丙酮沉淀，過濾得到白色沉淀物，所得沉淀物用一定量的去離子水溶解，用截留分子量為8000～14000的透析帶去離子水透析3d，每8h換水，凍干得到白色產(chǎn)物。

pH敏感性衍生物（DCMCs-PAA）的合成[9]：0.1g上述凍干產(chǎn)物溶解在50mL水中，隨后加入75μL的丙烯酸單體，室溫攪拌2h，N2除氧后，加入自由基引發(fā)劑APS（過硫酸銨）0.02g，在油浴上70℃攪拌反應(yīng)2h。所得溶液用去離子水透析3d，每8h更換透析液，冷凍干燥得產(chǎn)品。

1.2.2 殼聚糖衍生物的傅里葉紅外光譜測定 取一定量待測物質(zhì)，KBr壓片處理，在400～4000cm-1范圍內(nèi)利用紅外光譜儀測定其紅外圖譜。

1.2.3 DCMCs-PAA臨界膠束濃度（CMC）的測定 臨界膠束濃度是兩親性物質(zhì)在溶劑中締合形成膠束的最低濃度，在濃度小于CMC時，物質(zhì)呈單體狀態(tài)，而當(dāng)濃度大于CMC時，借助于分子間、分子內(nèi)、氫鍵等作用力能夠自發(fā)形成膠束。

芘標(biāo)準(zhǔn)液的制備[10]：準(zhǔn)確稱量60.7mg芘，以10mL丙酮溶解，再量取0.5mL置于10mL容量瓶中，丙酮定容，取0.4mL，置于10mL容量瓶，丙酮定容，得芘標(biāo)準(zhǔn)液。

不同濃度DCMCs-PAA芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：將制備好的芘標(biāo)準(zhǔn)儲備液，分別吸取0.1mL，置8個10mL刻度管中，N2吹干丙酮，將濃度分別為1.0×10-4、1.0× 10-3、5.0×10-3、1.0×10-2、5.0×10-2、1.0×10-1、5.0×10-1、1.0mg/mL的DCMCs-PAA溶液加入到上述8個刻度管中，即可得芘濃度為6.0×10-7mol/L的DCMCs-PAA芘標(biāo)準(zhǔn)溶液，超聲分散30min，再65℃加熱3h，靜置12h后測定芘的熒光光譜，根據(jù)圖譜中芘的特征發(fā)射峰的比值，依據(jù)數(shù)學(xué)方法進行擬合計算，確定DCMCs-PAA的CMC。激發(fā)波長設(shè)置為334nm，激發(fā)狹縫設(shè)置為5.0nm，發(fā)射狹縫設(shè)置為2.5nm，掃描范圍360～460nm。

1.2.4 不同pH條件下DCMCs-PAA的Zeta電位與粒徑分布測定 分別取10mg DCMC-PAA粉末溶于10mL人工模擬胃液（SGF，pH1.2）、10mL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.0）和10mL人工模擬腸液（SIF，pH7.4），分別測定其Zeta電位與粒徑分布。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察（TEM） 取不同pH條件下的待測膠束溶液，稀釋后，用微量取樣器將膠束溶液滴加到銅網(wǎng)上，利用JEM-2010HR型透射電子顯微鏡觀察并拍照。

1.2.6 DCMCs-PAA包覆VD3納米膠束的包封率及體外釋放 載VD3膠束的制備：取10mg VD3和30mg DCMCs-PAA溶于40mL乙醇中，10℃下暗處攪拌2h，再用去離子水透析24h，冷凍干燥得到DCMCs-PAA載VD3膠束粉末。

VD3-乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制一系列濃度分別為0、5、10、15、20、25、30、35μg/mL的VD3-乙醇溶液，在265nm的條件下，利用紫外可見分光光度計測其吸光度，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

包封率（EE）的測定：取1mg上述凍干的VD3膠束粉末溶于1mL乙醇中，12000r/min攪拌離心15min，取上清液稀釋一定倍數(shù)后測其吸光度，包封率按下式計算：EE（%）=膠束包裹的VD3的量/最初使用的VD3的量×100

體外釋放實驗[11]：分別取10mL膠束溶液置于3個透析袋中，再將其分別放入90mL SGF、PBS、SIF緩沖溶液中，100r/min的速率下在37℃條件下恒溫振蕩，在設(shè)定的時間間隔內(nèi)，分別取5mL透析液，在265nm條件下測其吸光度，根據(jù)VD3標(biāo)準(zhǔn)曲線計算對應(yīng)的釋放量，每次取完透析液后再補加入相同體積的釋放介質(zhì)，累積釋放量按下式計算。

式中，mv為載藥粉末中VD3的總量，V0是總釋放體系的總體積（100mL），Cn代表第n次取樣測定的VD3的濃度，Ve=5mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DCMCs-PAA的合成與表征

DCMCs-PAA的簡要合成過程見圖1，羧甲基殼聚糖的C-2位的-NH2具有很高活性，易與其他官能團發(fā)生反應(yīng)。本實驗首先利用N，N-二甲基十六烷基叔胺與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)生成一種蠟狀黃色中間產(chǎn)物，再與羧甲基殼聚糖發(fā)生反應(yīng)生成兩親性殼聚糖衍生物，最后在APS的作用下與丙烯酸發(fā)生反應(yīng)得到最終產(chǎn)物。圖2為PAA、DCMCs和DCMCs-PAA的紅外圖譜，1453cm-1和1710cm-1的峰分別對應(yīng)PAA的-CH2-的彎曲振動和羧酸基團中的C=O伸縮振動。2921cm-1和2852cm-1對應(yīng)的峰為DCMCs中長鏈亞甲基的伸縮振動，721cm-1峰的出現(xiàn)證明DCMCs中季銨鹽基團的引入，而在DCMCs-PAA中1723cm-1處相對于DCMCs中增強的吸收峰和1466cm-1的吸收峰分別表明PAA中羧酸基團和亞甲基基團的引入，相對于DCMCs圖譜，DCMCs-PAA的其他特征峰未有明顯變化。以上結(jié)果表明PAA成功嫁接到了DCMCs上。

圖1 兩親性殼聚糖衍生物的合成過程Fig.1 The synthesis process of amphiphilic chitosan derivatives

圖2 殼聚糖衍生物及聚丙烯酸的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectra of chitosan derivatives and PAA

2.2 臨界膠束濃度（CMC）的測定

臨界膠束濃度是衡量膠束穩(wěn)定性的重要參數(shù)。本實驗采用采用芘作為疏水熒光探針，芘對其周圍微環(huán)境的極性非常敏感，當(dāng)溶液中芘的濃度小于10-5mol/L時，在360～460nm范圍利用熒光分光光度計可以測得芘的五重發(fā)射峰（圖3），其中第一發(fā)射峰（I1，372）和第三發(fā)射峰（I3，383）的比值可以用來描述膠束溶液的特性，由圖4可以看出，隨著溶液中膠束濃度的增大，I1/I3的比值逐漸減小，當(dāng)增加到一定濃度后基本沒有變化，根據(jù)此變化，利用Boltzmann函數(shù)擬合，確定其突變點，過此突變點的公切線與高濃度時的水平切線的交點即為臨界膠束濃度。本實驗測得其CMC值為95mg/L，該值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于一些低分子表面活性劑的臨界膠束濃度，比如SDS（十二烷基磺酸鈉，CMC為2.3×103mg/L）。較低的CMC值保證了即使在較大的稀釋情況下，膠束也能夠保持其穩(wěn)定性，這對于其用于活性分子載體方面具有重要意義。

圖3 芘-膠束溶液的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectrum of pyrene incorporated into DCMCs-PAA micelle

圖4 372nm與383nm熒光強度的比值隨膠束濃度的變化Fig.4 The change of intensity ratio（I372/I383）versus the concentration of DCMCs-PAA values

2.3 Zeta電位、粒徑分布及透射電鏡

圖5顯示了不同pH條件下的DCMCs-PAA膠束的Zeta電位、粒徑分布與放大105倍的透射電鏡圖。在PBS緩沖溶液（pH7.0）中，測得其Zeta電位為+35.3mV，平均粒徑為134.4nm，TEM圖片顯示其具有良好的球形形態(tài)，部分粘連可能是因為TEM制樣過程中水分的蒸發(fā)造成的。在SIF溶液（pH7.4）中，TEM圖片顯示，膠束形態(tài)變得不規(guī)準(zhǔn)且出現(xiàn)了變形甚至降解的現(xiàn)象，這可能是因為在堿性環(huán)境中，膠束分子中氫鍵作用力變?nèi)酰瑫r-COO-間排斥力增強，再加上膠束表面電荷的降低（+23.9mV），最終使得膠束變得不規(guī)整，粒徑增大（349.1nm）且分布不規(guī)整。相反，在SGF溶液（pH1.2）中，由于溶液中H+的作用，膠束分子間氫鍵增強，使得膠束更加穩(wěn)定，而膠束表面電荷與H+的排斥力作用使膠束粒徑變?。?13.4nm），Zeta電位（44.1mV）增大。

2.4 DCMCs-PAA膠束包覆VD3的體外釋放實驗

圖6為VD3溶解在乙醇中，在265nm處測得的吸收曲線，由圖6可以看出，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性相關(guān)系數(shù)（R2）達(dá)到了0.9992，說明溶液的濃度基本與VD3的濃度成線性關(guān)系，可以根據(jù)VD3的吸光度計算體外釋放實驗中其釋放情況。

圖5 SIF，PBS和SGF中膠束的Zeta電位、粒徑分布與透射電鏡圖（105×）Fig.5 The Zeta potential,size distribution and TEM of DCMCs-PAA micelle in SIF,PBS and SGF（105×）

圖6 VD3-乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 The standard curve of VD3dissolved in ethanol

根據(jù)1.2.6的方法，測得包封率（EE）為57.3%，這與其他一些兩親性聚合物膠束包覆紫杉醇、阿霉素等抗癌藥物的包封率接近[12-13]。圖7為SIF、PBS和SGF溶液中DCMCs-PAA包覆VD3的體外釋放曲線圖，由圖7可以看出，3個pH條件下，緩釋曲線在最開始的5h內(nèi)都存在突釋現(xiàn)象，也稱為釋放的第一階段，這是由于膠束表面吸附的一些游離VD3的釋放。在之后的37h內(nèi)，SIF、PBS和SGF中VD3的累積釋放量達(dá)到穩(wěn)定的69.2%、53.6%和42.1%，這個階段為釋放的第二階段。持續(xù)釋放對于維持體內(nèi)VD3的濃度以及提高其生物活性具有重要意義。釋放結(jié)果顯示，在SIF溶液中VD3的釋放速率最快、釋放量最大，這可能是因為由于在堿性環(huán)境中，膠束分子間作用力的減弱以及表面電荷的變化，造成膠束的變形甚至解體，從而造成VD3的快速釋放，這和2.3結(jié)果相一致；相反在SGF溶液中，由于膠束分子間作用力以及氫鍵的增強等因素，膠束變得更穩(wěn)定，從而釋放速率相對最低、釋放量最小。膠束的上述pH響應(yīng)性行為，對于控制活性成分的釋放行為具有重要意義，而且由于人體的多種pH環(huán)境，對于控制活性成分的釋放部位也具有一定的參考意義。

圖7 載VD3膠束在不同pH條件下的體外釋放曲線Fig.7 In vitro release of VD3-loaded DCMCs-PAA micelle in different pH

3 結(jié)論

本文首先合成了一種兩親性殼聚糖衍生物（DCMCs），然后再嫁接上一種pH敏感性材料聚丙烯酸（PAA）而成功制備了pH響應(yīng)性DCMCs-PAA納米膠束，該納米膠束具有良好的球形，表面Zeta電位為正，粒徑較小。將該納米膠束包裹VD3后于3種pH條件下進行體外釋放實驗，結(jié)果顯示VD3在SIF中具有最快釋放速率以及最大釋放量，PBS次之，SGF最小。結(jié)果表明DCMCs-PAA納米膠束對VD3具有較高包封率，且對pH具有較強的響應(yīng)性，適宜作為一些疏水性食品功能性成分的潛在納米載體。

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pH-responsive amphiphilic chitosan derivative-based nanomicelles：Preparation，characterization and in vitro release of Vitamin D3

LI Wen-jian1，PENG Hai-long1，2，*，XIONG Hua1，NING Fang-jian1，ZHANG Jian-fei1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China；2.Department of Chemical Engineering，Nanchang University，Nanchang 330031，China）

A novel amphiphilic and pH-responsive nanomaterial was synthesized using carboxymethyl chitosan，N，N-dimethylhexadecylamine and acrylic acid.The structure property and critical micelle concentration of the nanomaterial was characterized.The material has the capability of forming core-shell micelles in aqueous solution with critical micelle concentration of 95mg/L.The micelles exhibited different size in diverse pH conditions，and the Zeta potential were all positive charged.Vitamin D3was used as a model molecule，and the results indicated that the solubility of VD3was improved with higher encapsulation efficiency（EE，57.3%）.The in vitro release of VD3from the micelle in different pH solution indicated that the VD3-loaded micelle has the highest accumulative release（69.2%）in simulated intestinal fluid（SIF），while the lowest（42.1%）in simulated gastric fluid（SGF）.This novel core-shell micelle might be a potential biological carrier for VD3or other bioactive food agents.

carboxymethyl chitosan；pH-responsive；micelle；Vitamin D3；in vitro release

TS218

A

1002-0306（2014）10-0125-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.019

2013－09－13 *通訊聯(lián)系人

黎文建（1988-），男，碩士研究生，研究方向：功能性食品。

國家自然科學(xué)基金委員會資助項目（21266020）；國家自然科學(xué)基金委員會資助項目（21201098）；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室專項（SKLF-ZZA-201305）。