胰腺癌組織SOX9的表達水平與腫瘤進展及預(yù)后的關(guān)系

孟凡斌 郭克建

胰腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，預(yù)后極差。其占美國惡性腫瘤死亡原因的第四位[1]。近年對其病因以及進展機制的研究雖然取得了一些進展，仍不足以提高其不佳的治療效果[2-3]。SOX9 ，SRY (sex determining region Y)-box 9，是SOX基因家族中的一員，胚胎期，胃、腸、肝臟、膽管及胰腺等多種器官的定向分化過程中SOX9都是必不可少的參與因子，而在成體，SOX9陽性細胞可分化為肝、膽管、小腸、胰腺上皮細胞，并向上述器官提供細胞來源[4-7]。而多項研究表明，SOX9在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用[8-12]。本研究通過免疫組織化學(xué)染色結(jié)合臨床病理及預(yù)后資料對比分析，結(jié)合細胞體外實驗，探究胰腺癌中SOX9的表達水平及臨床病理學(xué)意義。

材料與方法

一、材料

1.臨床病理材料 2007年1月至2011年12月中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院具有完整臨床資料的胰腺癌手術(shù)切除標本62例，其中男性46例，女性16例；年齡35～75歲，中位年齡59歲，術(shù)后病理證實均為原發(fā)性胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)。62例中，胰腺頭、頸部癌54例，體、尾部癌8例。所有病例均經(jīng)隨訪，隨訪時間4～63個月。此外，因胰腺良性腫瘤或胰腺外傷而切除的正常胰腺組織標本5例，胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(IPMN) 標本15例及胰腺癌組織中散在分布有胰腺上皮內(nèi)瘤樣病變(pancreatic intraepithelial neoplasia，PanIN)標本18例也包含在本研究中。上述正常胰腺、胰腺癌、IPMN及PanIN標本均施行SOX9免疫組織化學(xué)染色觀察SOX9在組織中的表達情況。

本研究所涉及的人體標本、相關(guān)臨床數(shù)據(jù)及相關(guān)實驗已獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，并于取材前簽署知情同意書。

2.細胞及培養(yǎng)條件 人胰腺癌細胞系CAPAN-2、BxPC3及PANC-1均購自 American Type Culture Collection (ATCC)。細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清 (FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，孵育于37 ℃、含有5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

二、實驗方法

1.免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)SP法，應(yīng)用SP法免疫組織化學(xué)超敏試劑盒(兔，KIT-9706/9707/9708)?？乖迯?fù)采用pH 6.0的檸檬酸緩沖液121 ℃高壓熱修復(fù)3 min，動物非免疫血清(羊)室溫封閉30 min后滴加一抗(SOX9多克隆抗體，Millipore，1∶1000；鼠抗Ki67，1∶50，Abcam；鼠抗p53 ，1∶200， Abcam； 鼠抗CEA，1∶400，Abcam；鼠抗CA19-9，1∶100，Abcam；鼠抗CD34，1∶100，Abcam)4 ℃孵育過夜。次日依次滴加二抗(生物素標記的抗兔或鼠IgG,1∶200,Vector Laboratories) 30 min及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶37 ℃ 15 min。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定：參考Sung[13]文獻評分方法：每張切片400倍顯微鏡下隨機選取 5個視野：①陽性細胞數(shù)：計算5個視野的陽性細胞的平均百分數(shù)分為4級：陽性細胞數(shù)1～24% 為1分；25%～49%為2分；50%～74%為3分；大于75%為4分。②染色強度：無著色0分；淺黃色1分；黃或深黃色2分；褐或棕褐色3分，上述兩項相乘為分級標準:≥4分定義為高表達，<4分定義為低表達。

2.細胞免疫熒光染色 細胞爬片至匯合度達到70%左右開始進行染色步驟。一抗為SOX9多克隆抗體(Millipore,1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后加入二抗(驢抗兔594紅色熒光二抗，Life Technologies，A21207,1∶200)，室溫避光孵育1 h。加入0.5 μg/ml DAPI避光染色10 min后封片鏡檢、拍照。

3.QRT-PCR 采用RNA分離試劑盒Trizol 提取并純化細胞株總RNA，所有RNA樣本濃度均稀釋至1 μg/μl，根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。熒光實時PCR 反應(yīng)體系25 μl(TaKaRa 2×SYBRR Pre-ix ExTaqTM 12.5 μl，100 nmol/L上、下游引物各1 μl，Cdna 2 μl，H2O 8.5 μl)，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min變性；95 ℃ 5 s，60 ℃30 s，40個循環(huán)，所有反應(yīng)均設(shè)立復(fù)孔，并以DEPC水代替模板cDNA作為陰性對照。引物均由Invitrogen公司設(shè)計、合成。SOX9上游引物：5′-GTACCCGCACTTGCACAAC-3′；下游引物：5′-TCGCTCTCGTTCAGAAGTCTC-3′；GAPDH 上游引物5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′；下游引物5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。QRT-PCR結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法：即目標細胞株標本中SOX9的閾值循環(huán)數(shù)(CT)值與其相對應(yīng)的GAPDH 的CT 值相減，得到校正CT 值。以BxPC-3細胞株為對照，其余兩種細胞株與其進行比較，比較公式：2-ΔΔCt=2-[(ΔCt目標細胞株目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)-(ΔCt對照細胞株目的基因-ΔCt內(nèi)參基因)]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS(19.0版)統(tǒng)計軟件。SOX9蛋白表達水平與病人臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系采用卡方檢驗。Kaplan-Meier法單因素分析計算累積生存率。P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SOX9在正常胰腺組織、IPMN、PanIN及胰腺癌中的表達情況

為了探討SOX9蛋白在正常胰腺及各種胰腺腫瘤性病變中的表達情況，我們以免疫組織化學(xué)染色方法分別對上述四種組織進行染色分析。結(jié)果表明，在上述四種組織中，SOX9均有陽性表達，且均表達在細胞核中。在正常胰腺組織，SOX9 100%(5/5)表達，主要表達于腺泡中心細胞及胰腺導(dǎo)管上皮細胞(圖1A)。在IPMN及PanIN，SOX9呈100%(IPMN：15/15；PanIN：18/18)的陽性表達，陽性細胞為腫瘤上皮細胞(圖1B， C)。而在胰腺癌，83.87%(52/62)在腫瘤上皮細胞呈陽性表達(圖1D)，其中高表達62.90%(39/62)(圖2A)，低/無表達37.10%(23/62) (圖2B)。上述結(jié)果表明，無論是正常胰腺、癌前病變的IPMN及PanIN，還是惡性腫瘤PDAC，SOX9均呈陽性表達。

A．正常胰腺；B．IPMN；C．PanIN；D．PDAC圖1 SOX9在正常胰腺組織、IPMN、PanIN及PDAC中的表達(免疫組織化學(xué)染色)

A．低表達；B．高表達圖2 SOX9在PDAC中的高表達及低表達(免疫組織化學(xué)染色)

二、SOX9蛋白表達水平與PDAC病人臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

為了探討SOX9的表達水平與胰腺癌生物學(xué)行為的關(guān)系，我們對62例胰腺癌組織進行免疫組織化學(xué)染色，將SOX9在胰腺癌組織中的表達水平與腫瘤的臨床病理數(shù)據(jù)及預(yù)后資料做了統(tǒng)計分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SOX9蛋白表達水平與PDAC腫瘤浸潤深度(χ2=4.449，P=0.034)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.433，P=0.032)呈正相關(guān)，有統(tǒng)計學(xué)意義。而SOX9蛋白表達水平與年齡(P=0.196)、性別(P=0.196)、腫瘤大小(P=0.173)、腫瘤分化程度(P=0.522)、TNM分期(P=0.057)、術(shù)前血清CA19-9水平(P=0.082)、血管浸潤(P=0.381)、神經(jīng)浸潤(P=0.449)、組織CA19-9表達(P=0.553)、組織Ki67表達(P=0.550)、組織CEA表達(P=0.101)、組織CD34血管表達(P=0.582)及組織P53表達(P=0.475)等均無明顯相關(guān)性。(表1)

三、SOX9蛋白表達水平與胰腺癌病人術(shù)后生存的關(guān)系

我們用Kaplan-Meier法對62例病人進行單因素分析發(fā)現(xiàn)：SOX9蛋白高表達PDAC病人(術(shù)后中位生存時間為12個月)較低表達者(術(shù)后中位生存時間為26個月)預(yù)后差(χ2=6.446，P=0.011)，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(圖3)

圖3 Kaplan?Meier生存曲線：SOX9蛋白表達與62例PDAC病人預(yù)后的關(guān)系

四、各種胰腺癌細胞系SOX9表達情況

為了觀察SOX9在不同分化程度及惡性程度胰腺癌細胞中的表達情況，我們選取了三種不同的胰腺癌細胞系：高分化的CAPAN-2、中分化的BxPC-3及低分化的PANC-1[14]，分別作了免疫熒光染色分析其SOX9表達比例及qRT-PCR檢測這幾種細胞系SOX9 mRNA表達水平。我們的免疫熒光染色結(jié)果顯示，這三種細胞系SOX9陽性細胞比率分別為：BxPC-3：62% ； CAPAN-2：68% ； PANC-1：92%(圖4)。而qRT-PCR結(jié)果顯示，在這三種細胞系中，低分化的PANC-1 SOX9 mRNA表達水平(23.68±3.06)明顯高于中、高分化的BXPC-3(1.00±0.02)和CAPAN-2(1.09±0.18)。

表1 SOX9蛋白表達與PDAC病人臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

討 論

既往有研究表明，在肝、膽道及胰腺的胚胎發(fā)育過程中，SOX9陽性細胞位于這三種器官組織的生發(fā)中心，SOX9陽性始祖細胞不僅可分化為肝內(nèi)外膽管上皮細胞、胰管上皮細胞，且可向上述組織提供充足的細胞來源[6]。這使得我們對SOX9在胰腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中是否也能起到類似作用產(chǎn)生了興趣。我們在以往的工作中對IPMN組織標本做的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果[15]顯示，SOX9主要表達于呈乳頭絨毛狀增生的上皮結(jié)構(gòu)的基底部，這一特點在胃型及腸型IPMN中尤其突出。由于胃型及腸型IPMN的組織構(gòu)造分別與胃黏膜腺體及結(jié)腸腺瘤相似，而干細胞理論認為，消化管絨毛狀上皮結(jié)構(gòu)的始祖細胞-干細胞恰恰位于其絨毛狀結(jié)構(gòu)的基底部。SOX9主要表達于絨毛乳頭狀結(jié)構(gòu)基底部這一特點在IPMN進展至惡性后，就逐漸消失了，SOX9陽性細胞像在胰腺癌組織中一樣，雜亂無章地散布于癌組織中，無任何規(guī)律性。SOX9在IPMN中這種特殊的表達方式，干細胞標志物CD44同樣具有，且免疫熒光染色提示SOX9與CD44可在同一細胞表達。上述研究結(jié)果提示我們，SOX9不僅在胰腺的發(fā)生及臟器正常功能的維持中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，同時在胰腺癌及其癌前病變的發(fā)生發(fā)展中也可能扮演了重要角色。我們的假設(shè)也在其他團隊的研究中得到了證實，Kopp 等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，SOX9在胰腺腺泡細胞向?qū)Ч芗毎俚桨┣安∽働anIN的發(fā)展過程中是必不可少的，即SOX9陽性細胞極有可能是PansIN甚至是癌的前體細胞。新近發(fā)表的文獻證實，NF-κB介導(dǎo)的 SOX9的去甲基化導(dǎo)致胰腺癌干細胞侵襲能力的增加[17]。而另一項研究證明SOX9可介導(dǎo)缺氧依賴的相關(guān)基因表達并提高胰腺癌細胞的惡性度[18]。

A：BxPC?3；B：CAPAN?2；C：PANC?1。圖中紅色熒光為SOX9，藍色熒光為DAPI。各圖中左下角圖片為白色方框部分的放大像圖4 各種胰腺癌細胞系SOX9免疫熒光染色圖像

我們及其他團隊的研究結(jié)果均高度提示SOX9在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中是一個關(guān)鍵因子，SOX9表達水平的高低對腫瘤的生物學(xué)行為有重要的影響。當前，多種基因的表達水平已經(jīng)被用于臨床監(jiān)測胰腺癌的發(fā)生、評估預(yù)后及監(jiān)測復(fù)發(fā)，如CA19-9及CEA等[19-20]。因此我們希望SOX9能作為一個獨立指標應(yīng)用于臨床，用來判斷胰腺癌的存在及預(yù)測其生物學(xué)行為。我們將免疫組織化學(xué)染色得到的SOX9蛋白表達水平與胰腺癌臨床病理資料進行的統(tǒng)計分析結(jié)果雖然提示SOX9高表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)(圖3)，但在腫瘤大小、TNM分期等其他指標中差異未有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能和我們的樣本量小有關(guān)，這有待我們今后擴充樣本量后做進一步的分析。但我們的結(jié)果至少說明，SOX9的表達水平可能對胰腺癌的進展及預(yù)后有提示作用。

胰腺癌對化療藥物的廣泛耐藥是對其進行復(fù)發(fā)的防治及復(fù)發(fā)后非手術(shù)治療不理想的主要原因之一。作為目前唯一被FDA批準的應(yīng)用于胰腺癌的化療藥，吉西他濱的問世為胰腺癌的治療帶來了福音。但是仍有大量的病人對吉西他濱耐藥，使得胰腺癌的內(nèi)科治療效果極差，故找到控制胰腺癌對吉西他濱耐藥的作用機制，找到控制其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶點，對解決困擾胰腺癌治療的耐藥問題至關(guān)重要。我們對三種不同分化水平的胰腺癌細胞系的體外實驗結(jié)果顯示低分化的PANC-1細胞的SOX9陽性細胞比率及SOX9 mRNA表達水平均顯著高于高、中分化的CAPAN-2及BxPC-3細胞。而有研究報道PANC-1細胞的吉西他濱耐藥能力也高于另外兩組細胞[21]。綜合這些研究結(jié)果，我們對后續(xù)研究提出了如下假設(shè)：SOX9表達水平高的胰腺癌細胞，其惡性程度高，對吉西他濱的耐藥能力也強，即SOX9很可能是控制胰腺癌細胞分化及吉西他濱耐藥的關(guān)鍵因子。這一點有待我們今后更加深入、系統(tǒng)的研究來做進一步的驗證。

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