迷迭香酸對大鼠抑郁樣行為的作用及其機制研究

晉 翔，劉 鵬，張雅紅

迷迭香酸對大鼠抑郁樣行為的作用及其機制研究

晉 翔，劉 鵬，張雅紅

目的探討迷迭香酸(RA)對慢性不可預見應激(CUS)抑郁模型大鼠抑郁樣行為的改善作用及機制。方法 將大鼠隨機分為6組，每組16只。A組:生理鹽水組;B組:低劑量RA組;C組:高劑量RA組;D組:CUS+生理鹽水組;E組:CUS+低劑量RA組;F組:CUS+高劑量RA組。建立CUS抑郁大鼠模型，干預結(jié)束后對部分大鼠(每組8只)進行曠場實驗、強迫游泳行為學測試后，取海馬組織蛋白樣品，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)水平，免疫印跡(Western-blot)法檢測細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(pERK1/2)的蛋白表達水平。各組其余8只大鼠進行水迷宮實驗。結(jié)果 行為學實驗、海馬組織BDNF的ELISA檢測、pERK1/2及ERK1/2蛋白定量及水迷宮實驗目標象限停留時間百分比結(jié)果D組與A、B、C組比較均存在顯著差異(P＜0．05)，F(xiàn)組與D組存在顯著差異(P＜0．05)，而E組與 D、F組之間無顯著差異(P ＞0．05)，A、B、C 組之間差異也無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。結(jié)論 CUS模型大鼠會表現(xiàn)出類似于抑郁癥患者的抑郁樣行為，而一定劑量的RA干預能改善這一行為，其機制可能為RA通過上調(diào)抑郁大鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中ERK1/2的磷酸化，促進其釋放BDNF，進而發(fā)揮抗抑郁效應。

迷迭香酸;抑郁;行為學科和活動;大鼠，Sprague-Dawley

抑郁癥是目前臨床最常見的精神疾患，中藥用于抗抑郁治療取得了較好的效果［1-4］。臨床用于改善抑郁情緒的香蘇散主要成分是紫蘇草，已有動物實驗研究證實紫蘇草具有良好的抗抑郁作用［5-6］。迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)是紫蘇草內(nèi)天然存在的多酚類化合物，是紫蘇草的主要活性成分，具有多種生物活性。有研究證實，紫蘇草及其主要代謝產(chǎn)物咖啡酸可以通過誘導小鼠海馬齒狀回細胞的增殖從而減輕抑郁模型小鼠的抑郁癥狀。本研究通過構(gòu)建慢性不可預見應激(chronic unpredictable stress，CUS)抑郁大鼠模型，觀察不同劑量RA對大鼠抑郁樣行為的作用。在行為學結(jié)果的基礎上，進一步觀察RA對海馬細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinases，pERK1/2)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表達的影響，探討RA抗抑郁的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 實驗動物為雄性SD大鼠96只，鼠齡6周，體重180～230 g，購自中科院動物所(合格證號:20120174)。所有大鼠在干預前均常規(guī)飼養(yǎng)1周，無食水限制，飼養(yǎng)條件:12 h光暗循環(huán);溫度(23．0±1．1)℃;濕度40% ～60%。RA 購自Sigma-Aldrich公司;抗 ERK1/2兔多克隆抗體、抗pERK1/2鼠單克隆抗體購自Cell Signaling公司;大鼠酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)檢測BDNF試劑盒購自Sun Red公司。

1.2 實驗分組 將大鼠隨機分為6組，每組16只。A組:生理鹽水組;B組:低劑量RA組;C組:高劑量RA組;D組:CUS+生理鹽水組;E組:CUS+低劑量RA組;F組:CUS+高劑量RA組。

1.3 實驗步驟 D、E、F組接受為期21 d的CUS造模，A、B、C組不接受CUS造模，從同一天開始計時。從第15天開始，A、D組每天腹腔注射生理鹽水(1 ml/kg)，B、E 組每天腹腔注射 RA 5 mg/kg，C、F組每天腹腔注射RA 10 mg/kg，均持續(xù)14 d。RA經(jīng)生理鹽水溶解后，每天上午9:00～10:00給藥。

隨后，每組隨機抽取8只大鼠通過強迫游泳實驗和曠場實驗等行為學測試檢測習性無助和探索行為，在測試結(jié)束后處死大鼠，分離海馬組織，通過免疫印跡(Western-blot)法檢測海馬組織ERK1/2和pERK1/2的表達情況，并使用ELISA試劑盒檢測BDNF的水平。每組剩余的8只大鼠進行Morris水迷宮測試，以檢測大鼠的學習記憶行為。

1.4 CUS模型構(gòu)建 CUS模型的建立參考等Koo［7］的方法。造模大鼠稱重，按每籠5或6只飼養(yǎng)，在21 d內(nèi)接受慢性、不可預知的溫和刺激，模擬人類日常生活中接受的慢性低強度應激。每天從日間、夜間刺激中各挑選一種對大鼠進行處理，順序隨機，連續(xù)不重復，使大鼠不能夠預計刺激的出現(xiàn)。日間刺激包括:①在強迫游泳桶中加入4℃冰水，每桶中1只大鼠，游泳5 min;②每只大鼠單獨接受足底電擊2 mA，間隔10 s，電擊4 s，重復2次;③搖晃鼠籠10 min，強度沒有明確要求，以大鼠不能站穩(wěn)為指標，方向不定;④大鼠放于束縛罐中束縛2 h;⑤單籠隔離所有大鼠，孤獨3 h;⑥將大鼠放入狹窄的桶中，擁擠3 h。夜間刺激包括:①持續(xù)電燈光照;②在鼠籠墊料上噴灑水，潮濕處理;③將鼠籠傾斜45度;④彩燈置于鼠籠上方，持續(xù)閃爍;⑤禁水、禁食12 h。

1.5 動物行為學指標檢測方法

1.5.1 強迫游泳實驗:強迫游泳實驗是用來研究應激狀態(tài)下動物的反應能力，大鼠在強迫游泳過程中，會呈現(xiàn)以下幾種狀態(tài):①漂浮不動;②攀爬容器壁;③游泳。其中漂浮不動時間是用來反映動物抑郁樣行為的指標。將大鼠放入內(nèi)徑18 cm、高40 cm的圓柱形玻璃瓶中，水溫25～27℃，水深25 cm，以確保大鼠不會觸到瓶底并且不會爬到瓶外，每桶1只大鼠。實驗第1天，每只大鼠預游泳15 min，隨后取出擦干放入籠中。24 h之后再次將大鼠放入水中即開始計時，連續(xù)觀察5 min，累計大鼠漂浮不動的時間，并計算其占總時間的百分比，百分比越高，大鼠的抑郁狀態(tài)越重。

1.5.2 曠場實驗:曠場實驗是用來檢測動物的自主活動以及抑郁、焦慮樣行為，自主活動包括大鼠在10 min的水平運動總距離和在曠場中心區(qū)進入的時間等指標。本研究以大鼠運動距離作為評判大鼠抑郁、焦慮狀態(tài)的指標。每只大鼠單獨放于曠場行為觀察箱(47 cm×47 cm×47 cm)中，10 s適應期后開始記錄大鼠行為10 min，測定大鼠的水平運動距離，運動距離越長，抑郁、焦慮狀態(tài)越輕。

1.5.3 水迷宮實驗:將水池均等分為4個象限，將大鼠站臺固定在第3象限，站臺高度低于水平面2 cm，進行空間學習訓練，將每只大鼠頭朝池壁放入水中，放入位置為隨機取4個象限之一。記錄大鼠找到水下平臺的時間。在前幾次訓練中，如果這個時間超過60 s，則引導大鼠到平臺，讓大鼠在平臺上停留10 s。隨后將大鼠移開、擦干。必要時將大鼠放在150W的白熾燈下烤5 min，放回籠內(nèi)。每只大鼠每天訓練4次，兩次訓練間隔15～20 min，連續(xù)訓練5 d。最后一次獲得性訓練結(jié)束后第2天，將平臺撤除，開始60 s的探查訓練。將大鼠由原先平臺象限的對側(cè)放入水中。記錄大鼠在目標象限停留的時間，并計算其占總時間百分比，百分比越高，大鼠的抑郁狀態(tài)越輕。

1.6 ERK1/2和pERK1/2的表達檢測 將大鼠斷頭處死后，迅速在冰上剝離大腦，置于冰浴的PBS中，分離兩側(cè)海馬組織，按組收集海馬組織，稱重。取部分海馬組織稱重后加入適當體積的裂解液，勻漿裂解20 min，以12 000轉(zhuǎn)/min離心20 min，吸取上清液即為蛋白提取液。參照BCA蛋白定量試劑盒說明書行蛋白定量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、顯色，掃描各Western-blot條帶并分析，以目的條帶灰度與內(nèi)參條帶灰度的比值表示ERK1/2、pERK1/2的表達量。

1.7 BDNF水平檢測 將大鼠斷頭處死后，迅速在冰上剝離大腦，置于冰浴的PBS中，分離兩側(cè)海馬組織，按組收集海馬組織，稱重。取部分海馬組織按重量加入適量體積的PBS(1 ml/100 mg)，迅速勻漿，以2000～3000轉(zhuǎn)/min離心20 min，取上清為測試樣品，并進行蛋白定量。參照ELISA檢測說明書，逐步加入相應試劑和樣品，并配置標準曲線。待加入終止液后，迅速在酶標儀上讀取吸光度值，檢測波長450 nm。將OD值與標準曲線核對，并與蛋白定量結(jié)果校準，得到相應樣品的BDNF含量。

1.8 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 11．5統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組以上數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或多因素方差分析進行比較，兩兩數(shù)據(jù)比較前進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性則采用SNK檢驗，方差不齊則采用 Dunnett T3檢驗。α=0．05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 強迫游泳 漂浮不動時間經(jīng)雙因素方差分析顯示，造模分組因素方差分析(F=9.987，P=0.003)、藥物劑量分組因素方差分析(F=4.142，P=0.023)差異均有統(tǒng)計學意義。漂浮不動時間多重比較結(jié)果，D組與A、B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)組與D組差異無統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而E組與D、F組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，A、B、C組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表1。

2.2 曠場實驗 運動距離經(jīng)雙因素方差分析顯示，造模分組因素方差分析(F=12.184，P=0.001)、藥物劑量分組因素方差分析(F=3.287，P=0.047)差異均有統(tǒng)計學意義。多重比較結(jié)果，D組與A、B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)組與D組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而E組與D組、F組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，A、B、C組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.3 水迷宮實驗 目標象限停留時間百分比經(jīng)雙因素方差分析顯示，造模分組因素方差分析(F=8.336，P=0.006)、藥物劑量分組因素方差分析(F=3.532，P=0.038)差異均有統(tǒng)計學意義。多重比較結(jié)果，D組與A、B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)組與D組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而E組與D組、F組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，A、B、C組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表1。

2.4 ERK1/2和pERK1/2的表達 ERK1/2的造模分組因素方差分析(F=0.098，P=0.756)、藥物劑量分組因素方差分析(F=0.118，P=0.889)差異均無統(tǒng)計學意義。pERK1/2的造模分組因素方差分析(F=29.812，P=0.000)、藥物劑量分組因素方差分析(F=3.881，P=0.031)差異均有統(tǒng)計學意義。pERK1/2表達的多重比較結(jié)果，D組與A、B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，F(xiàn)組與D組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而E組與D組、F組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，A、B、C組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1、圖1。

表1 6組大鼠行為學指標、海馬BDNF水平、ERK 1/2、pERK 1/2測定結(jié)果(±s)

表1 6組大鼠行為學指標、海馬BDNF水平、ERK 1/2、pERK 1/2測定結(jié)果(±s)

注:BDNF:腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，ERK 1/2:細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，pERK1/2:磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶;A組:生理鹽水組，B組:低劑量迷迭香酸(RA)組，C組:高劑量RA組，D組:CUS+生理鹽水組;E組:CUS+低劑量RA組，F(xiàn)組:CUS+高劑量RA 組;與 A 組比較，a P ＜0．05;與 B組比較，c P ＜0．05;與 C 組比較，e P ＜0．05;與 D 組比較，g P ＜0．05

組別 鼠數(shù) 漂浮不動時間百分比(%)運動距離(mm)目標象限停留時間百分比(%)ERK1/2表達比率pERK1/2表達比率BDNF水平(ng/mg)A 組 8 18．62 ±2．43 2909．18 ±242．45 23．81 ±3．25 0．81±0．08 1．25 ±0．08 0．87 ±0．07 B 組 8 16．98 ±2．27 2676．07 ±226．66 21．98 ±3．41 0．78 ±0．07 1．18 ±0．07 0．82 ±0．08 C 組 8 17．92 ±2．36 3033．90 ±238．28 24．38 ±3．19 0．79 ±0．08 1．19 ±0．08 0．90 ±0．07 D 組 8 28．89 ±2．42ace 1808．93 ±240．89ace 11．51 ±3．36ace 0．77 ±0．08 0．64 ±0．08ace 0．52 ±0．07ace E 組 8 24．45 ±2．35 2098．68 ±242．45 18．24 ±3．29 0．78 ±0．10 0．76 ±0．10 0．67 ±0．08 F 組 8 18．23 ±2．33g 2737．46 ±236．64g 20．47 ±2．32g 0．79 ±0．09 0．86 ±0．09g 0．77 ±0．08g

圖1 不同處理組對海馬ERK1/2和pERK1/2表達水平的影響

2.5 ELISA檢測BDNF水平

造模分組因素方差分析(F=12．322，P=0．001)，藥物劑量分組因素方差分析(F=3．580，P=0．037)，差異均有統(tǒng)計學意義。BDNF水平多重比較結(jié)果，D組與A、B、C組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，F(xiàn)組與D組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，而E組與D、F組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，A、B、C組之間差異亦無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)，見表1。

3 討論

RA是一種水溶性的聚苯化合物，存在于許多植物提取物中。目前研究發(fā)現(xiàn)，RA除了具有抗氧化效應［8］和抗炎活性［9］以外，還可以部分緩解動物的抑郁樣行為［10］。但是，這一抗抑郁效應尚缺乏更有力的證據(jù)，而且其作用機制還不清楚。相對于急性應激如強迫游泳抑郁動物模型而言，CUS抑郁模型可以更好地模擬抑郁發(fā)生的社會和環(huán)境應激，而且可以更好地篩查抗抑郁藥及其作用機制［11-12］。本實驗初步觀察了RA對CUS抑郁模型大鼠的抑郁樣行為及對海馬的ERK信號通路磷酸化和BDNF表達的影響。結(jié)果顯示，強迫游泳實驗提示CUS可以導致大鼠漂浮時間的延長，曠場實驗提示CUS可以導致大鼠運動能力受損，而水迷宮實驗提示CUS可以導致大鼠學習記憶能力受損。這些結(jié)果都表明CUS大鼠在經(jīng)歷了一系列持續(xù)、隨機的應激事件后表現(xiàn)出了相應的抑郁樣行為，進而表明CUS抑郁模型作為一個已經(jīng)成熟建立起來的動物模型，很好地模擬了與抑郁癥相關的核心癥狀。與之相對應的，強迫游泳實驗提示高劑量RA(10 mg/kg)可以緩解CUS所致漂浮時間延長的現(xiàn)象，而低劑量無明顯作用;曠場實驗提示高劑量RA可以緩解CUS所致運動距離減少的現(xiàn)象，而低劑量無明顯作用;而水迷宮實驗提示高劑量RA可以緩解CUS所致記憶能力減弱的現(xiàn)象，而低劑量無明顯作用。上述結(jié)果提示高劑量RA具有明確抗抑郁效應，而低劑量RA無顯著抗抑郁效應。

抑郁癥的主要表現(xiàn)為情緒以及認知功能受損，因此，與情緒以及認知相關的腦區(qū)一直是研究抑郁癥發(fā)病與治療機制所關注的熱點。海馬是調(diào)節(jié)學習和記憶的重要腦區(qū)之一，其被包埋于復雜的神經(jīng)結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡中間，這些結(jié)構(gòu)(包括杏仁核、前扣帶回、眶額和背外側(cè)皮質(zhì)、紋狀體、內(nèi)側(cè)顳葉等)都與抑郁癥的發(fā)病有關［13-16］。根據(jù)實驗動物模型、抑郁癥患者大腦形態(tài)學和尸檢改變、影像學、抗抑郁藥物治療作用等方面的證據(jù)，以及抑郁癥發(fā)生和轉(zhuǎn)歸過程中海馬等大腦結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的顯著形態(tài)變化(包括海馬等區(qū)域突觸的重塑、膠質(zhì)細胞的改變、神經(jīng)元興奮性改變、神經(jīng)元數(shù)量的變化以及神經(jīng)元苔蘚纖維發(fā)芽的變化等)，研究者認為海馬的結(jié)構(gòu)及可塑性變化可能是抑郁癥發(fā)病及抗抑郁藥物作用的重要環(huán)節(jié)［17-21］。本實驗進一步觀察了海馬BDNF的表達水平和ERK的磷酸化程度，結(jié)果顯示，CUS可以導致大鼠海馬BDNF和pERK1/2表達減少。

高劑量 RA可以緩解 CUS所致 BDNF和pERK1/2表達減少的現(xiàn)象，而低劑量無明顯作用。此外，A、B、C組之間的行為學指標和 BDNF、pERK1/2表達情況均無差異統(tǒng)計學意義，表明RA干預并未對正常對照大鼠造成行為學的影響，也未影響正常大鼠海馬的BDNF、pERK1/2表達。

綜上所述，RA對CUS抑郁模型大鼠有一定的抗抑郁效應，這一作用可能與其調(diào)節(jié)抑郁大鼠海馬BDNF的水平和ERK1/2磷酸化程度有關。

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Effect and Mechanism of Rosmarinic Acid on Depressive-like Behaviors in Rats

JIN Xiang1a，LIU Peng1b，ZHANG Ya-hong2(1．Naval General Hospital，a．DepartmentofMedical Psychology，b．Department of Hepatobiliary Surgery，Beijing 100048，China;2，Department of Psychosomatic Medicine，Xijing Hospital，the Fourth Military Medical University，Xi＇an 710032，China)

ObjectiveTo explore the anti-depressive effects of Rosmarinic Acid(RA)and itsmechanisms on depressed ratswith chronic unpredictable stress(CUS)．MethodsThe ratswere randomly divided into six groups(n=16 for each group):group A(physiological saline)，group B(low-dose RA)，group C(high-dose RA)，group D(CUS+physiological saline)，group E(CUS+low-dose RA)and group F(CUS+high-dose RA)．After the interventions，part of the established ratmodels(n=8 for each group)underwent open-field and forced swimming tests，and then hippocampal tissue protein sampleswere taken out．Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)levelswere detected by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)，and levels of extracellular regulated protein kinase(ERK1/2)and phosphorylation extracellular regulated protein kinase(pERK1/2)were detected byWestern-blotmethod．The remaining animals(n=8 for each group)underwent the Morriswatermaze(MWM)test．ResultsThe differences in results of ethology test，ELISA detection for hippocampal tissue，albumen quantitations of pERK1/2 and ERK1/2 and retention percentage of target quadrant in watermaze experiment in group D were statistically significant(P ＜0．05)，and the differenceswere also statistically significant between group F and D(P ＜0．05)，but there was no statistical significance between group E with group D and F(P ＞0．05)，and the differences between group A，B and C showed no statistical significances(P ＞0．05)．ConclusionCUS ratmodels have depression-like behaviors，and RA can have an antidepressant-like effect．The antidepressant-like effectof RAmay be achieved by increasing ERK1/2 phosphorylation level in hippocampus astroglia cells and improving BDNF releasing．

Rosmarinic acid;Depression;Behavioral disciplines and activities;Rat，sprague-dawley

R749．42;R-332

A

2095-140X(2014)05-0014-05

10．3969/j．issn．2095-140X．2014．05．004

100048北京，海軍總醫(yī)院醫(yī)學心理科(晉翔)，肝膽外科(劉鵬);710032西安，第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院身心科(張雅紅)

劉鵬，E-mail:liupengmail100@163．com

2013-12-10 修回時間:2014-02-26)

·論著·