蘋(píng)果渣發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸和揮發(fā)性香氣成分分析

呂春茂，劉 暢，孟憲軍，鄭 鵬，徐境一

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

蘋(píng)果渣發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸和揮發(fā)性香氣成分分析

呂春茂，劉 暢，孟憲軍，鄭 鵬，徐境一

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

為提高蘋(píng)果渣的利用價(jià)值，采用固態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵蘋(píng)果渣制備單細(xì)胞蛋白，并通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)蘋(píng)果渣制備單細(xì)胞蛋白的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味進(jìn)行分析。結(jié)果表明：蘋(píng)果渣發(fā)酵前后游離氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL，呈味氨基酸含量由2.73 mg/mL增加至11.45 mg/mL，7 種必需氨基酸含量由0.87 mg/mL增加至5.33 mg/mL；蘋(píng)果渣經(jīng)過(guò)發(fā)酵后揮發(fā)性香氣成分由發(fā)酵前的17 種增加到38 種，芳香族化合物的種類(lèi)及含量有所增加，并新產(chǎn)生了酯類(lèi)、呋喃類(lèi)、含氮類(lèi)化合物；發(fā)酵后蘋(píng)果渣香氣濃郁，風(fēng)味得到顯著改善。

蘋(píng)果渣；固態(tài)發(fā)酵；游離氨基酸；揮發(fā)性香氣成分

我國(guó)的蘋(píng)果加工規(guī)模是世界上最大的，每年因蘋(píng)果加工而產(chǎn)生的鮮果渣達(dá)100萬(wàn)t[1]，除少量蘋(píng)果渣被用于生產(chǎn)果膠、檸檬酸、膳食纖維及食用菌培養(yǎng)基質(zhì)[1]外大部分被廢棄，既污染環(huán)境又使其中富含的大量有機(jī)營(yíng)養(yǎng)白白浪費(fèi)。為了提高蘋(píng)果渣的利用價(jià)值，人們利用微生物發(fā)酵增加蘋(píng)果渣中的蛋白質(zhì)含量[2]。同未發(fā)酵的蘋(píng)果渣相比，發(fā)酵蘋(píng)果渣中富含蛋白質(zhì)、脂肪、核酸、VC和無(wú)機(jī)鹽[3-4]，有較好的香味和性能，具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5]。目前，對(duì)發(fā)酵蘋(píng)果渣的研究主要集中于菌體蛋白的利用，而發(fā)酵蘋(píng)果渣中氨基酸及產(chǎn)香特性的分析鮮有報(bào)道。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，其種類(lèi)及含量直接影響發(fā)酵蘋(píng)果渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味，而蘋(píng)果渣發(fā)酵后揮發(fā)性香氣成分也是判斷發(fā)酵蘋(píng)果渣風(fēng)味的重要指標(biāo)。發(fā)酵蘋(píng)果渣主要的用途是分離制備菌體蛋白，進(jìn)而生產(chǎn)人造食用蛋白，這對(duì)于補(bǔ)充和豐富人類(lèi)的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)具有重要戰(zhàn)略意義，其次也可以作為飼料添加劑，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)利用混合菌種發(fā)酵寒富蘋(píng)果渣，采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)鮮果渣及發(fā)酵蘋(píng)果渣中游離氨基酸的種類(lèi)及含量進(jìn)行測(cè)定，并采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[6]聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)發(fā)酵前、后蘋(píng)果渣的揮發(fā)性香氣成分，用以研究發(fā)酵過(guò)程對(duì)蘋(píng)果渣營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及風(fēng)味的影響，為更好開(kāi)發(fā)利用發(fā)酵蘋(píng)果渣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寒富蘋(píng)果 沈陽(yáng)市東陵區(qū)深井子金德勝果園。

蘋(píng)果渣：寒富蘋(píng)果鮮榨蘋(píng)果渣，在60 ℃烘干48 h，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，備用；培養(yǎng)基：蘋(píng)果渣料水比1∶3（m/m），121 ℃滅菌20 min；菌種：黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母，均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室；菌種活化：將黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母進(jìn)行斜面活化，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）固體培養(yǎng)基活化，30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h；擴(kuò)大培養(yǎng)：挑取經(jīng)過(guò)活化的菌種，制成菌懸液，黑曲霉在50 mL PDA固體培養(yǎng)基，熱帶假絲酵母和啤酒酵母在100 mL PDA液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，在30 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。

1.2 儀器與設(shè)備

滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；電熱干燥培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)；L-8800型氨基酸自動(dòng)分析儀、離心機(jī) 日本日立公司；7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀 美國(guó)安捷倫公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng)；多功能粉碎機(jī)永康帥通工具有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵蘋(píng)果渣的制備

在制備好的蘋(píng)果渣培養(yǎng)基中，按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入混合菌種，混合菌種包括黑曲霉、熱帶假絲酵母和啤酒酵母，按照1∶3∶3（V/V）混合，30 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。1.3.2 游離氨基酸的測(cè)定

1.3.2.1 樣品制備

1 g發(fā)酵蘋(píng)果渣，加10 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值為7.5，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的混合酶（木瓜蛋白酶與中性蛋白酶的質(zhì)量比為1∶2），55 ℃酶解3 h，8 000 r/min離心20 min，按1∶1（V/V）加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%磺基水楊酸，充分振蕩，12 000 r/min離心20 min，取上清液5 mL于蒸發(fā)皿中蒸干。用10 mL 6 mol/mL鹽酸將樣品由蒸發(fā)皿中轉(zhuǎn)移至水解管內(nèi)，抽真空、封管，110 ℃水解24 h。冷卻、開(kāi)瓶、過(guò)濾、定容至50 mL，取5 mL于蒸發(fā)皿中蒸干，冷卻后加2.5 mL 0.02 mol/mL鹽酸于蒸發(fā)皿中將蒸干樣溶解，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.2.2 氨基酸分析儀色譜條件

色譜柱：2622C陽(yáng)離子型交換樹(shù)脂（4.6 mm× 6.0 mm）；進(jìn)樣量20 μL；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液流速0.4 mL/min；分析柱柱溫50 ℃；泵1泵壓9.1×106Pa；茚三酮溶液流速0.35 mL/min；反應(yīng)柱柱溫136 ℃，泵2泵壓1.1×106Pa；紫外檢測(cè)器在脯氨酸440 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，其他氨基酸在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

1.3.3 揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定

1.3.3.1 GC-MS樣品制備

將發(fā)酵完成的蘋(píng)果渣4 000 r/min離心20 min，上清液用二氯甲烷萃取，將萃取液30 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2 mL備用。

1.3.3.2 GC-MS條件

GC條件：色譜柱：DB-1701（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度280 ℃；升溫程序：40 ℃保持5 min，然后以10 ℃/min升至110 ℃，再以5 ℃/min 升至130 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃保持5 min；載氣He；進(jìn)樣量1 μL；分流進(jìn)樣，分流比50∶1。

MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；溶劑延遲3.00 min；質(zhì)量掃描范圍35.0～400.0 u。

1.3.3.3 數(shù)據(jù)處理

利用NIST05標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索各組分質(zhì)譜數(shù)據(jù)，參考文獻(xiàn)資料與標(biāo)準(zhǔn)譜圖確認(rèn)各揮發(fā)性香氣物質(zhì)的化學(xué)組分，按照峰面積歸一化法計(jì)算出各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸的含量及組成

游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)圖譜、新鮮蘋(píng)果渣及發(fā)酵蘋(píng)果渣中游離氨基酸圖譜分別如圖1、2、3所示，新鮮蘋(píng)果渣及發(fā)酵蘋(píng)果渣中游離氨基酸的測(cè)定結(jié)果如表1所示。由表1可知，發(fā)酵過(guò)程增加了蘋(píng)果渣中游離氨基酸的種類(lèi)及含量，游離氨基酸含量由3.25 mg/mL增加至15.68 mg/mL。發(fā)酵蘋(píng)果渣中谷氨酸的含量最高達(dá)2.53 mg/mL，其次為天冬氨酸、賴(lài)氨酸、丙氨酸含量分別為2.4、1.13、1.01 mg/mL，含量較少的氨基酸是半胱氨酸、蛋氨酸、組氨酸，含量分別為0.21、0.27、0.37 mg/mL。

新鮮蘋(píng)果渣中除色氨酸以外的其他7 種必需氨基酸的總含量為0.87 mg/mL，發(fā)酵蘋(píng)果渣中7 種必需氨基酸的總含量為5.33 mg/mL，這表明，發(fā)酵過(guò)程也顯著提高了必需氨基酸的含量，使蘋(píng)果渣更具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表1 新鮮蘋(píng)果渣及發(fā)酵蘋(píng)果渣中游離氨基酸的含量Table 1 Free amino acid contents of apple pomace and fermented apple pomace

氨基酸是食物味道的主要貢獻(xiàn)者[7]，其本身會(huì)呈現(xiàn)出酸、甜、苦、鮮等各種味道[8]，甜味類(lèi)氨基酸有甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸[9]，新鮮蘋(píng)果渣中甜味類(lèi)氨基酸

總含量為1.07 mg/mL，發(fā)酵蘋(píng)果渣中甜味類(lèi)氨基酸總含量為3.57 mg/mL；鮮味類(lèi)氨基酸有谷氨酸和天冬氨酸[9]，新鮮蘋(píng)果渣中鮮味氨基酸總含量為1.28 mg/mL，發(fā)酵蘋(píng)果渣中鮮味氨基酸總含量為4.93 mg/mL；呈苦味氨基酸有酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸[10]，新鮮蘋(píng)果渣中苦味氨基酸總含量為0.38 mg/mL，發(fā)酵蘋(píng)果渣中苦味氨基酸總含量為2.95 mg/mL。這些呈味氨基酸的含量由2.73 mg/mL增加到11.45 mg/mL。發(fā)酵蘋(píng)果渣中含量較高的呈味氨基酸分別為谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸，因此可認(rèn)為以上3 種氨基酸為發(fā)酵蘋(píng)果渣的特征性風(fēng)味物質(zhì)。

圖1 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)圖譜Fig.1 Standard spectrum of free amino acids

圖2 新鮮蘋(píng)果渣中游離氨基酸測(cè)定圖譜Fig.2 Spectrum of free amino acids in apple pomace

圖3 發(fā)酵蘋(píng)果渣中游離氨基酸測(cè)定圖譜Fig.3 Spectrum of free amino acids in fermented apple pomace

2.2 GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)揮發(fā)性香氣成分

圖4和圖5為蘋(píng)果渣發(fā)酵前和發(fā)酵后GC-MS總離子流量圖，分析鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。其中發(fā)酵前蘋(píng)果渣的揮發(fā)性香氣成分共17 種，包括醇類(lèi)1 種、醛類(lèi)2 種、酸類(lèi)2 種、芳香族7 種和烷烴類(lèi)5 種，其相對(duì)含量分別為4.02%、6.49%、6.4%、2.7%和2.24%；蘋(píng)果渣發(fā)酵后鑒定出38種揮發(fā)性香氣成分，包括醇類(lèi)1種、醛類(lèi)1種、酸類(lèi)1種、酯類(lèi)7種、芳香族10種、烷烴類(lèi)9種、含氮化合物5種、呋喃類(lèi)3種、噻吩類(lèi)1種，其相對(duì)含量分別為6.55%、1.48%、1.4%、2.42%、10.94%、4.85%、67.56%、3.37%和0.36%。

通過(guò)分析蘋(píng)果渣發(fā)酵前后揮發(fā)性香氣成分的種類(lèi)及含量，發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果渣發(fā)酵后酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及相對(duì)含量均減少，乙酸、己酸轉(zhuǎn)化成了其他香氣成分，對(duì)蘋(píng)果渣的風(fēng)味影響較小；發(fā)酵后新產(chǎn)生了7 種酯類(lèi)物質(zhì)且乙酸乙酯的相對(duì)含量最高，達(dá)到總量的1.36%，而乙酸乙酯是具有較強(qiáng)水果氣味的酯類(lèi)成分[11]，因此乙酸乙酯對(duì)蘋(píng)果渣發(fā)酵后風(fēng)味的增強(qiáng)具有重要貢獻(xiàn)；蘋(píng)果渣發(fā)酵后產(chǎn)生了3 種呋喃類(lèi)物質(zhì)，分別是丁內(nèi)酯、糠醇、1-（2-呋喃）-1,2-乙二醇，前2 種物質(zhì)具有甜香、焦糖香、面包香、咖啡香及堅(jiān)果香味[12-14]，且香味持久，因此丁內(nèi)酯、糠醇也是蘋(píng)果渣發(fā)酵制品重要的特征風(fēng)味物質(zhì)；蘋(píng)果渣發(fā)酵后較發(fā)酵前芳香類(lèi)物質(zhì)的種類(lèi)及含量都有所增加，其中變化明顯的為苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、苯乙酮，而苯乙醇是應(yīng)用較為廣泛的一種食用香料，具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣[15]及新鮮的面包和清甜的蜂蜜香氣[16]，苯甲醇具有花香氣味[17]，苯

甲醛具有堅(jiān)果香氣[14]，苯乙酮具有堅(jiān)果及水果香氣[16]，因此上述芳香類(lèi)物質(zhì)也是發(fā)酵蘋(píng)果渣香氣濃郁重要的特征風(fēng)味物質(zhì)。

發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生5 種含氮化合物，分別為吲哚、十六酰胺、順-9-十八碳烯酰胺、十五烷腈、齊墩果腈，其中吲哚具有糞臭和動(dòng)物氣息[16]，但其含量較低，所以它的存在不會(huì)使發(fā)酵蘋(píng)果渣產(chǎn)生令人不愉快的霉臭氣味。順-9-十八碳烯酰胺相對(duì)含量為38.96%，是所檢測(cè)出香氣成分中含量最高的，其次是齊墩果腈，相對(duì)含量達(dá)23.46%。順-9-十八碳烯酰胺在紅象牙芒果[18]中檢測(cè)到，齊墩果腈在松茸[19]及蠶蛹[20]中檢測(cè)到，但目前還沒(méi)有在發(fā)酵蘋(píng)果渣中鑒定到順-9-十八碳烯酰胺及齊墩果腈的相關(guān)報(bào)道，并且沒(méi)有對(duì)這2 種物質(zhì)香氣特征的描述，因此，順-9-十八碳烯酰胺及齊墩果腈對(duì)發(fā)酵蘋(píng)果渣氣味產(chǎn)生的作用還有待進(jìn)一步研究。

表2 發(fā)酵蘋(píng)果渣產(chǎn)生主要香氣成分Table 2 Volatile aroma components of fermented apple pomace

圖4 未發(fā)酵蘋(píng)果渣GC-MS總離子流量圖Fig.4 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of unfermented apple pomace

圖5 發(fā)酵蘋(píng)果渣GC-MS總離子流量圖Fig.5 GC-MS total ionic chromatogram of aroma components of fermented apple pomace

3 結(jié) 論

發(fā)酵蘋(píng)果渣中總游離氨基、必需氨基酸及呈味氨基酸的種類(lèi)及含量較高，均顯著高于未發(fā)酵蘋(píng)果渣氨基酸的種類(lèi)及含量，增加了蘋(píng)果渣的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。發(fā)酵過(guò)程有效地提高了蘋(píng)果渣香氣濃度及香味種類(lèi)，蘋(píng)果渣的風(fēng)味得到明顯改善。

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Analysis of Free Amino Acids and Aroma Components in Fermented Apple Pomace

Lü Chun-mao, LIU Chang, MENG Xian-jun, ZHENG Peng, XU Jing-yi
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The contents and kinds of free amino acids (FAAs) in apple pomace and fermented apple pomace were determined by amino acid analyzer. The aroma components in the unfermented and fermented samples were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Results showed that the content of FAAs was increased from 3.25 to 15.68 mg/mL, and the content of flavor amino acids was increased from 2.73 to 11.45 mg/mL after fermentation. Fermented apple pomace contained 7 essential amino acids and their total content was increased from 0.87 to 5.33 mg/mL. Seventeen and thirty eight volatile compounds were identified in the unfermented and fermented apple pomace, respectively. The types and contents of aromatic substances were increased. In the fermented apple pomace, esters, furans, and nitrogen-containing substances were produced. Fermentation improved the flavor of apple pomace.

apple pomace; fermention; free amino acids; volatile aroma components

TS255.36

A

1002-6630（2014）18-0146-05

10.7506/spkx1002-6630-201418029

2013-12-28

沈陽(yáng)市大型儀器共享項(xiàng)目（4130199-1102-01083909001）

呂春茂（1970—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：bt_lcm@126.com