間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準(zhǔn)確性評價

袁水林，熊 鼎，陳紅兵，高金燕，李 欣,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準(zhǔn)確性評價

袁水林1,2，熊 鼎1,2，陳紅兵1,3，高金燕2，李 欣1,2,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

研究建立了以β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為包被抗原、自制抗體為一抗、辣 根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG∶HRP為二抗、鄰苯二胺為底物的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法（ indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent，ELISA）。同時以反相高效液相色譜法定量檢測相同樣品中β-乳球蛋白含量，采用t檢驗方法來評價間接競爭ELISA的方法定量檢測β-乳球蛋白的準(zhǔn)確性。t檢驗方法結(jié)果顯示：在顯著水平α=0.05下，該間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白的測量值較為準(zhǔn)確。

牛乳過敏；β-乳球蛋白；間接競爭ELISA法；反相高效液相色譜

食物過敏是一種食物不良反應(yīng)，屬于機(jī)體對外源物質(zhì)產(chǎn)生的一種變態(tài)反應(yīng)[1]。目前，食物過敏的患病率呈增長趨勢[2]，估計有5%的兒童和3%～4%的成年人對食物過敏[3]。在堅果、雞蛋、牛奶、魚類、甲殼綱動物、大豆、小麥和花生這8大類主要食物過敏原中[4]，大約有0.4%的兒童和0.2%的成年人對小麥和大豆過敏，1.5%的兒童和0.2%的成年人對雞蛋過敏，2.5%的兒童和0.3%的成年人對牛乳過敏[2]。

牛乳及乳制品因其含有較高的營養(yǎng)價值而受到廣大消費(fèi)者的青睞，但同時， 牛乳及牛乳制品又是常見的8大食物過敏原之一[4]。有研究報道[5]，嬰幼兒對牛乳過敏的發(fā)病率已經(jīng)高達(dá)7.5%。絕大部分牛乳過敏反應(yīng)屬于IgE介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)，也有非IgE介導(dǎo)的，如胃腸道紊亂[6]。牛乳中有20多種蛋白可能會導(dǎo)致牛乳過敏[7]，其中酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白為牛乳中的最主要過敏原。牛乳中的β-乳球蛋白作為反芻動物乳清中最主

要的蛋白質(zhì)，在IgE介導(dǎo)的牛乳過敏反應(yīng)中，60%的病人是對β-乳球蛋白過敏[8]。其含量占乳清蛋白的50%，牛乳總蛋白含量的10%。β-乳球蛋白單體的分子質(zhì)量大約為18.3 kD，含有162 個氨基酸殘基，等電點(diǎn)為5.3，分子內(nèi)含有5 個二硫鍵[9-10]，屬于Lipocalin蛋白家族[11]。

根據(jù)實(shí)驗室已建立的間接競爭ELISA，對實(shí)驗條件加以改進(jìn)，建立了檢測鮮乳中牛乳β-乳球蛋白含量的方法。檢測方法的評價引入統(tǒng)計學(xué)中t檢驗方法來驗證間接競爭ELISA法檢測牛乳以及乳清中β-乳球蛋白含量的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗以反相高效液相色譜法定量牛乳以及乳清中的β-乳球蛋白的質(zhì)量濃度作為對照，以確保實(shí)驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶 江西光明乳業(yè)有限責(zé)任公司。

β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（純度90%）、羊抗兔IgG∶HRP酶標(biāo)二抗 德國Sigma公司；低分子質(zhì)量蛋白Marker 中國Tiangen公司；抗血清（一抗） 實(shí)驗室自制[12]。

1.2 儀器與設(shè)備

ALLEGRA 64R Centrifuge冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；PB-10型pH計 德國Sartorius公司；Mode 1860酶標(biāo)儀、PowerPac 3000電泳 儀、Quantity One凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；LC-20AT反相高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳清樣品的制備

1.3.1.1 鮮牛乳脫脂

用四層消毒紗布過濾鮮牛乳，除去鮮牛乳中大部分雜質(zhì)，然后用高速冷凍離心機(jī)（8 000 r/min、4 ℃、10 min）脫脂，得到脫脂乳。

1.3.1.2 沉淀酪蛋白

分離脫脂乳中的酪蛋白，本實(shí)驗采用的是等電點(diǎn)沉淀的方法[13]：脫脂乳在40 ℃的水浴鍋內(nèi)保溫，用5 mol/L鹽酸調(diào)其pH值至4.6，30 min后用高速冷凍離心機(jī)離心分離（8 000 r/min、15 min），收集離心上清液，得到乳清。

1.3.1.3 SDS-PAGE檢測乳清蛋白

用不連續(xù)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）電泳，根據(jù)分子質(zhì)量對分離蛋白進(jìn)行檢測。所用濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%；分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%。樣品在濃縮膠中時，恒定電流6 mA，電泳時間30 min；進(jìn)入分離膠后，恒定電流在12 mA，電泳時間65～75 min。用低分子質(zhì)量蛋白Marker作為參比。

1.3.2 間接競爭ELISA法檢測蛋白濃度

96 孔酶標(biāo)板每孔加入2.5 μg/mL 100 μL的包被抗原（β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品），放于4 ℃冰箱過夜。次日恢復(fù)至室溫，傾去包被液，每孔加磷酸鹽吐溫（tween phosp hate buffered saline，PBST）緩沖液300 μL洗滌3 次，每次5 min，扣干。每孔加250 μL 1%的明膠作為封阻液，37 ℃孵育1 h。恢復(fù)至室溫，傾去封阻液，PBST滿孔洗滌3 次，每次5 min，扣干。倍比稀釋的競爭抗原50 μL與50 μL稀釋的抗血清在板外反應(yīng)l h后，加入包被有抗原的孔，37 ℃孵育1h后，以PBST洗滌，扣干3 次。每孔加入100 μL 1∶5 000稀釋的羊抗兔 IgG:HRP， 37 ℃保溫保濕1 h后，以PBST洗滌扣干3 次。每孔加反應(yīng)底物100 μL，37 ℃保溫避光反應(yīng)15 min。每孔50 μL 2mol/L H2S O4終止反應(yīng)。設(shè)置陰性孔（磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替競爭抗原和抗血清），陽性孔（PBS代替競爭抗原）。用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定。

1.3.3 反相高效液相色譜法測定β-乳球蛋白

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精確稱取β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配制成30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于4 ℃冰箱中備用，上樣前用孔徑為0.22 μm的針式濾頭過濾。

1.3.3.2 樣品溶液的制備

取鮮牛乳以及上述乳清，鮮牛乳用超純水稀釋50 倍，乳清用超純水稀釋10 倍，上樣前用孔徑為0.22 μm的針式濾頭過濾。

1.3.3.3 色譜條件

本實(shí)驗采用的色譜條件[14]為：色譜柱Inertsil WP300 C8（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相A為含0.05%三氟乙酸的乙腈，流動相B為含0.1%三氟乙酸的超純水；梯度洗脫程序為流動相A在15 min內(nèi)從30%上升到50%，然后用2 min從50%降到30%；流速1 mL/min；柱溫25℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量50 μL。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

1.3.4.1 間接競爭ELISA法檢測蛋白濃度競爭抑制率：

1.3.4.2 t檢驗參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 牛乳乳清的分離電泳圖

圖1 牛乳乳清的 SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE pattern of whey proteins

由圖1可以看出，牛乳經(jīng)過脫脂以及等電點(diǎn)沉淀可除去水牛乳中的絕大部分酪蛋白后，得到的牛乳乳清主要含β-乳球蛋白、α-乳白蛋白，還含有少量乳鐵結(jié)合蛋白以及牛血清蛋白，而酪蛋白幾乎沒有。

2.2 間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白質(zhì)量濃度

圖2 β-乳球蛋白間接競爭ELISA競爭抑制曲線Fig.2 Indirect competitive ELISA curve of bovine β-lactoglobulin

根據(jù)本實(shí)驗室[12]建立的間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的最佳條件，確定實(shí)驗所用包被液、競爭抗原、一抗（抗血清）、酶標(biāo)二抗質(zhì)量濃度。通過預(yù)實(shí)驗分析，競爭抗原質(zhì)量濃度在1～1 000 ng/mL范圍內(nèi)接競爭ELISA抑制曲線有較好的線性關(guān)系，作該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。第1次檢測樣品所用的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，后9 次重復(fù)實(shí)驗樣品所需要的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法一樣。得到的標(biāo)準(zhǔn)方程為：y=-0.045 3x+89.996，R2=0.984 1。

根據(jù)1.3.2節(jié)實(shí)驗步驟和1.3.4.1節(jié)競爭抑制率的計算公式，定量檢測不同牧場的鮮牛乳和乳清，重復(fù)10 次，得到牛乳中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度含量見表1，牛乳乳清中β-乳球蛋白含量見表2。

表1 間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度Tabllee 11 β-Lactoglobulin concentration in fresh milk assayed using indirect competitive ELISA mg/mL

表2 間接競爭ELISA法檢測牛乳乳清中β-乳球蛋白質(zhì)量濃度Tabllee 22 β-Lactoglobulin concentration in whey assayed using indirect competitive ELLIISSAA mg/mL

表3 反相高效液相色譜定量檢測標(biāo)準(zhǔn)品中-乳球蛋白Table 3 Quantitation of -lg concentration in standard substance using RP-HPLC

表4 反相高效液相色譜法定量樣品中β-乳球蛋白Table 4 Analysis of -lg concentration in milk and whey using RP-HPLC mg/mL

2.3 反相高效液相色譜法定量β-乳球蛋白質(zhì)量濃度

根據(jù)1.3.3.3節(jié)反相高效液相色譜法測定β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的色譜條件，配制所需標(biāo)準(zhǔn)品溶液以及樣品溶液。由反相高效液相所得超純水、β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、鮮牛乳以及牛乳乳清的圖譜如圖3所示，β-乳球蛋白保

留時間16.847 min。根據(jù)各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積見表3，采用外標(biāo)法建立定量β-乳球蛋白質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4，y=2 302.4x-19 339，R2=0.997 7。

圖3 反相高效液相色譜圖Fig.3 RP-HPLC chromatograms

圖4 反相高效液相測定牛乳β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve for β-lg concentrations of standard substance using RP-HPLC

根據(jù)圖4建立的牛乳β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由反相高效液相色潽法所測鮮牛奶以及乳清的峰面積，平行取3 次樣品，定量各牧場鮮牛奶以及乳清中所含的β-乳球蛋白含量見表4。

2.4 評價間接競爭ELISA法檢測牛乳中β-乳球蛋白含量的準(zhǔn)確性

根據(jù)反相高效液相色譜法定量每個牧場中牛乳以及乳清中的β-乳球蛋白質(zhì)量濃度（表3），本實(shí)驗用t檢驗方法來驗證間接競爭ELISA法檢測牛乳以及乳清中β-乳球蛋白含量（表1與表2）的準(zhǔn)確性。根據(jù)1.3.4.2節(jié)的計算公式， 計算出各t檢驗參數(shù)見表5。

表5 鮮牛乳及乳清檢驗參數(shù)Table 5 The -test parameters for milk and whey

在顯著水平α=0.05下，查自由度n-1=9的t-分布表，得臨界值t0.025（9）=2.262，由表5的各組數(shù)據(jù)的觀測值|T0|＜t0.025（9），即在顯著水平為α=0.05下，使用間接競爭ELISA法檢測的測量值較為準(zhǔn)確。

3 討 論

檢測食物過敏原的方法有多種，其中ELISA是最為常用的方法之一。ELISA最早由Engvall課題組[15]與Schuurs課題組[16]同時建立。它利用酶標(biāo)記物同抗原抗體復(fù)合物的免疫反應(yīng)與酶的催化放大作用相結(jié)合，即保持了酶催化反應(yīng)的敏感性，又保持了抗原抗體反應(yīng)的特異性，因而極大地提高了靈敏度[17]。目前常用的ELISA有以下幾類，間接ELISA、夾心ELISA、競爭ELISA和間接競爭ELISA。本研究采用間接競爭ELISA檢測牛乳中的主要過敏原-β-乳球蛋白，兼有間接ELISA以及競爭ELISA方法的優(yōu)點(diǎn)。本研究在實(shí)驗室建立的對間接競爭ELISA的方法檢測β-乳球蛋白[12]的基礎(chǔ)上，對實(shí)驗條件適當(dāng)改進(jìn)，最終使用實(shí)驗條件為包被液質(zhì)量濃度2.5 μg/mL、一抗?jié)舛认♂?∶300 000、二抗?jié)舛认♂?∶5 000，發(fā)現(xiàn)在此條件下測定的β-乳球蛋白標(biāo)準(zhǔn)品線性關(guān)系最佳，吸光強(qiáng)度最強(qiáng)。

間接競爭ELISA檢測方法因其具有高特異性、高靈敏度、快速等優(yōu)點(diǎn)，目前間接競爭ELISA的方法檢測牛乳中的β-乳球蛋白含量有許多研究[18-20]。布冠好等[21]以檢

測的批內(nèi)誤差和批間誤差來說明該方法的靈敏度和重復(fù)性，但未對該檢測方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評估。張海英等[22]從回收率、精密度、特異性等方面比較了兩個品牌的ELISA試劑盒，對方法的準(zhǔn)確性并未采用其他有效方法來驗證而只是用加標(biāo)回收率來說明，不能排除方法本身帶來的的系統(tǒng)誤差。趙金龍[23]和張忠華[24]等也未使用其他方法來驗證間接競爭ELISA檢測方法的準(zhǔn)確性。本研究應(yīng)用間接競爭ELISA方法與RP-HPLC方法相結(jié)合來檢測β-乳球蛋白含量，通過統(tǒng)計學(xué)t檢驗方法來評價間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準(zhǔn)確性。通過本研究對該方法準(zhǔn)確性的評價，為鮮牛奶中β-乳球蛋白含量的檢測提供技術(shù)基礎(chǔ)，有助于解決我國食品安全中的過敏原牛乳β-乳球蛋白的檢測問題，為開發(fā)低敏性牛乳制品提供了一定的實(shí)驗依據(jù)和技術(shù)手段。

應(yīng)用RP-HPLC分析牛乳蛋白國內(nèi)外已有大量研究[25-27]，因該方法雖成本較高，但準(zhǔn)確靈敏，所以本實(shí)驗以該測量值為標(biāo)準(zhǔn)值來評價使用間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準(zhǔn)確性。然后使用t檢驗方法評價間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白的準(zhǔn)確性。t檢驗是應(yīng)用最多的統(tǒng)計分析方法之一，它具有計算簡單以及檢驗功效較高等優(yōu)點(diǎn)。從本實(shí)驗結(jié)果來看，在使用間接競爭ELISA方法檢測β-乳球蛋白10 個樣品的10 組實(shí)驗中，在顯著水平α=0.05下，各組樣品實(shí)驗數(shù)據(jù)的觀測值|T0|＜t0.025（9），即在顯著水平為α=0.05下，使用該實(shí)驗條件的間接競爭ELISA法檢測β-乳球蛋白的測量值較為準(zhǔn)確。

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Evaluation of the Accuracy of Indirect Competitive ELISA Used to Detect Milk β-Lactoglobulin

YUAN Shui-lin1,2, XIONG Ding1,2, CHEN Hong-bing1,3, GAO Jin-yan2, LI Xin1,2,*
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 2. School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330047, China; 3. Sino-German Joint Research Institute, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

An indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established with the standard β-lactoglobulin as the coated antigen, specif i c rabbit antibody against β-lactoglobulin as the primary antibody, horseradish peroxidase labeled goat anti-rabbit IgG:HRP as the secondary antibody and o-phenylenediamine as the substrate solution. Reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used as the reference method. The t-test method proved that the indirect competiti ve ELISA for detection of β-lactoglobulin was feasible and accurate. The results of t-test at a signif i cance level α = 0.5 showed that the indirect competitive ELISA was more accurate to detect the concentration of β-lactoglobulin.

milk allergy; β-lactoglobulin; indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay; reversed-phase highperformance liquid chromatography

TS207.3

A

1002-6630（2014）18-0100-05

10.7506/spkx1002-6630-201418020

2014-04-07

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK17B02）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31260204；31301522）；江西省自然科學(xué)基金項目（2012BAB204002）；江西省教育廳課題（GJJ12143）

袁水林（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)與工程。E-mail：yslin1989@163.com

*通信作者：李欣（1980—），女，副教授，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。E-mail：zhizilixin@hotmail.com