中鏈脂肪酸的抗菌作用：辛酸對悉生鹵蟲無節(jié)幼體接種蝦致病菌哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用

（印度Manonmaniam Sundaranar大學(xué)海洋科學(xué)和技術(shù)中心海洋生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室,Rajakkamangalam,Kanyakumari區(qū),泰米爾納德邦629502）

鹵蟲無節(jié)幼體被廣泛認(rèn)為是海洋魚類和甲殼類動(dòng)物孵化場最好的天然的長期可儲(chǔ)存的活餌料（Lavens等，1996）。這是因?yàn)辂u蟲屬擁有一些獨(dú)特的特征如體積小，容易攝食(Leger等，1986)，高營養(yǎng)價(jià)值(Browne等，1991)，對不同的培養(yǎng)環(huán)境具有高耐受力(Leger等，1987)，繁殖周期短(Reeve1963；Pwe?soone等，1980)等。鹵蟲屬也被用來作為提供營養(yǎng)物質(zhì)的帶菌物質(zhì)(Watanabae等，1983)，抗菌劑(Dixon等，1995)，疫苗(Campbell等，1993)和所有上述提到的產(chǎn)品都可能是通過提高原微生物菌群的特性而起到對宿主機(jī)體正效應(yīng)作用。鹵蟲屬也是一個(gè)被用來研究對蝦、龍蝦和其他甲殼蟲類疾病很好的生物體模型(Overton等，1981；Verschuere等，1999，2000a)。最近在豐年蝦鹵蟲上研究顯示，在一個(gè)悉生測試系統(tǒng)的儀器中研究食物成分在攻毒或不攻毒情況下對豐年蝦鹵蟲存活和生長的影響(Marques等2004、2005)。最近，建立一個(gè)限菌系統(tǒng)，使幼蟲在無菌條件下孵化、生長，為已知的細(xì)菌與宿主-微生物相互作用的研究提供便利，尤其是鹵蟲幼體(Marques等，2006)。

游離脂肪酸對病原微生物（包括包膜病毒、衣原體和細(xì)菌）具有抑制作用(Kabara等，1972；Kabara，1978；Isaacs等，1995；Petschow等，1996；Bergsson等，1998，1999)。關(guān)于脂肪酸的抗菌性能，大多數(shù)研究都集中在中鏈和長鏈脂肪酸。雖然短鏈和中鏈脂肪酸的抗菌機(jī)制不完全明白，但是它們能夠發(fā)揮抑菌和殺菌性能取決于生物體的生理狀況和外部環(huán)境的物理化學(xué)特性(Ricke，2003)。在未解離的形式，短鏈和中鏈脂肪酸能通過細(xì)菌細(xì)胞膜和游離于堿性細(xì)胞質(zhì)，從而增加了細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)子濃度(Cherrington等，1991；Sun等，1998)。結(jié)果表明，細(xì)胞必須消耗能量使細(xì)胞質(zhì)pH值維持在合適的水平。能量不能被用作其他代謝過程，從而抑制了細(xì)胞的生長。基于以上因素，本研究評估了中鏈脂肪酸辛酸對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌在體外的抗菌作用和辛酸在豐年蝦攻毒這兩種菌時(shí)的保護(hù)作用。

1 材料和方法

體外攻毒試驗(yàn)參照Defoirdt等(2005)方法，100尾鹵蟲無節(jié)幼體(齡II)在孵化后被轉(zhuǎn)入到4個(gè)無菌離心管中，每個(gè)離心管中隨機(jī)分配25尾，并含有過濾和滅菌海水及10 mM的辛酸。正對照組不含辛酸。試驗(yàn)介質(zhì)的pH值調(diào)整到7.0。鹵蟲幼體飼喂蒸壓懸浮的嗜水氣單胞菌（LVS3）,細(xì)胞密度大約為每日107CFU/ml。飼喂前，菌株在過濾的海水中的海洋瓊脂培養(yǎng)液中過夜，蒸壓后加入到鹵蟲幼體培養(yǎng)基中。然后，離心管被分別接種105CFU/ml的哈維氏弧菌和副溶血性弧菌。離心管在28℃旋轉(zhuǎn)器中離心孵育。測定60 h內(nèi)鹵蟲幼體的死亡率。每6 h測定一次每個(gè)處理的存活百分?jǐn)?shù)。為了上述目的，在飼養(yǎng)和添加細(xì)菌前通過用肉眼記錄鹵蟲幼體的數(shù)量，這都是在未打開并暴露在白熾燈下和維持悉生環(huán)境的透明的離心管中進(jìn)行的。鹵蟲無節(jié)幼體的累計(jì)死亡率指數(shù)(CMI)通過每次間隔記錄的死亡數(shù)的總和來計(jì)算(Immanuel等2001,2004,2007)，公式：

CMI=Dx1+Dx2+Dx3…Dxn。

D是x1，x2，x3…xn每次的死亡個(gè)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 第一個(gè)試驗(yàn)：測定不同濃度的辛酸(1、10和100 mM)對病原菌哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響(圖1)

圖1 不同濃度辛酸和不同時(shí)間間隔對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

對照組，病原體的生長直到試驗(yàn)結(jié)束。在高濃度辛酸組(100 mM)，兩種菌在5 h內(nèi)被完全抑制。但當(dāng)辛酸1 mM和10 mM濃度時(shí)，病原菌的生長沒有被完全抑制。

2.2 第二個(gè)試驗(yàn)：pH值不同時(shí)辛酸對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

測定pH值為5、6、7辛酸濃度為10 mM時(shí)對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抑制作用（圖2）。與pH值6、7（43%~46%）時(shí)相比，pH值為5（65%~80%）時(shí)辛酸對抑制兩種菌生長的作用最強(qiáng)。

圖210 mM辛酸在不同pH值條件下和不同時(shí)間間隔對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌生長的影響

2.3 第三個(gè)實(shí)驗(yàn)：體外攻毒實(shí)驗(yàn)

給鹵蟲無節(jié)幼體接種哈維氏弧菌和副溶血性弧菌，在攻毒試驗(yàn)期間從接種病毒開始到第6 h時(shí)死亡（表1）。在6 h期間，正對照組(無辛酸組)在攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌后其死亡率分別為23.3%和21.65%。同時(shí)，試驗(yàn)組即添加辛酸組死亡率分別為20%和16.65%。以此同時(shí)，負(fù)對照組(無病原菌和辛酸)無死亡率。

表1 添加10 mM辛酸pH值為7的培養(yǎng)基中攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的鹵蟲無節(jié)幼體的累積死亡百分?jǐn)?shù)

鹵蟲無節(jié)幼體在分別攻毒兩種菌時(shí)的死亡率百分?jǐn)?shù)隨著攻毒時(shí)間的延長呈線性增加。60 h內(nèi)，正對照組攻毒兩種菌后死亡率為100%。但是在添加10 mM辛酸的試驗(yàn)組，攻毒哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的鹵蟲無節(jié)幼體的死亡率分別為79%和76%。同時(shí)，負(fù)對照組的死亡率只有17%。統(tǒng)計(jì)分析表明，在試驗(yàn)期（60 h）各組間的累積死亡率差異顯著（P<0.05）。

2.4 CMI和降低的死亡率

攻毒哈維氏弧菌的正對照組的鹵蟲無節(jié)幼體的累計(jì)死亡率指數(shù)(CMI)為24 692.76，加10 mM辛酸后死亡率降低到16.3%，負(fù)對照為84.55%(表2)。

表2 不同處理組的CMI和降低死亡率的百分?jǐn)?shù)

同樣，攻毒副溶血性弧菌的正對照組的鹵蟲無節(jié)幼體的累計(jì)死亡率指數(shù)(CMI)為23 599.20，加10 mM辛酸后死亡率降低到20.61%，負(fù)對照為83.84%。通過t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析各組間的CMI呈顯著性差異(P<0.05)。

3 討論

脂肪酸已被開發(fā)作為幾個(gè)世紀(jì)的抗菌劑(Sun等，2002；Hogan等，1987；Wang等，1992；Petschow等，1996)。本試驗(yàn)，我們研究不同濃度的辛酸(1、10和100 mM)對哈維氏弧菌和副溶血性弧菌在pH值為6時(shí)的抗菌效果。在100 mM濃度、5 h時(shí)100%完全抑制病菌的生長。但是當(dāng)辛酸濃度為1 mM和10 mM時(shí)的抑菌效果所需時(shí)間延長。與本研究報(bào)道一致的是Defoirdt等(2006)報(bào)道不同濃度的短鏈脂肪酸例如甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸(1、10和100 mM)在pH值為6時(shí)對坎氏弧菌的生長抑制的影響。進(jìn)一步研究表明，當(dāng)辛酸濃度為100 mM時(shí)，所有的短鏈脂肪酸都顯示出對坎氏弧菌生長100%抑制，然而在其他兩個(gè)濃度時(shí)無效果。根據(jù)上述調(diào)查結(jié)果，Wolin(1969)報(bào)道，在pH值為6、10 mM的短鏈揮發(fā)性脂肪酸部分抑制大腸桿菌的生長。相似地，Van Immerseel等(2003)也報(bào)道，在同樣的pH值條件下，辛酸為100 mM時(shí)短鏈脂肪酸完全抑制腸炎沙門氏菌。

此研究還揭示辛酸對蝦病原菌生長抑制活性的pH值依賴性。在最低pH值為5時(shí)，生長抑制最高，然而在高pH值(6和7)時(shí)生長抑制相對較低(42%~46%)。Defoirdt等(2006)報(bào)道，短鏈脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)對坎氏弧菌的生長抑制作用也具有pH值依賴性。他們指出pH值為5時(shí)，生長被完全抑制，然而在pH值為6時(shí)，生長抑制被推遲，在pH值為7時(shí)無抑制效果。本研究結(jié)果與Wolin(1969)，Mc Han等(1993)和Van Immerseel等(2003)研究在不同pH值條件下短鏈脂肪酸對大腸桿菌和腸炎沙門氏菌生長抑制效果的結(jié)果存在相關(guān)性。生長抑制效果依賴pH值的原因?qū)嶋H上是因?yàn)樵诘蚿H值時(shí)，占主導(dǎo)地位的未解離的脂肪酸能通過細(xì)胞膜(Sun等，1998)。

本研究中，體外攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，鹵蟲無節(jié)幼體在分別攻毒副溶血性弧菌和哈維氏弧菌后的試驗(yàn)組的死亡率是非常低的(分別是20.61%和16.30%)。Defoirdt等(2006)也報(bào)道在攻毒坎氏弧菌后，鹵蟲幼體最好存活率組是添加了20 mM的短鏈脂肪酸(甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)組。他們的研究表明，在pH值7時(shí)攻毒坎氏弧菌情況，分別添加了20 mM的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸組的鹵蟲幼體的存活率分別為45%、48%、48%、42%和47%。此前，無論是體外和體內(nèi)研究都報(bào)道辛酸對各種魚類寄生蟲具有顯著的抗寄生蟲作用。并且據(jù)觀察辛酸對魚類健康無任何有害作用(Hirazawa等，2001a，b，c)。Wang等（1992）報(bào)道，脂肪酸的抗菌作用隨著鏈長度的增加而降低，中鏈脂肪酸的抗菌作用比長鏈脂肪酸更強(qiáng)。相似地報(bào)道，Isaacs等（1995）指出，含有8~12個(gè)碳的脂肪酸比長鏈脂肪酸的抗病毒和抗菌效果更好。辛酸含8個(gè)碳，中鏈脂肪酸與長鏈脂肪酸相比，疏水性較低且更易溶，其殺菌效果更好。

雖然辛酸對細(xì)菌的確切抑菌機(jī)制還不清楚，但眾多的假設(shè)已經(jīng)提出來解釋游離脂肪酸的一般抗菌活性模式。一種假設(shè)是短鏈和中鏈脂肪酸以它們未解離的形式擴(kuò)散到細(xì)菌細(xì)胞原生質(zhì)內(nèi)，然后解離，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)酸化(Sun等，1998)。較低的細(xì)胞內(nèi)pH值可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的酶失活(Viegas等，1991)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)抑制(Freese等，1973)。因?yàn)橹舅岜徽J(rèn)為是通過多種機(jī)制來殺死細(xì)菌的，這些分子引起潛在的細(xì)菌耐藥性可以忽略不計(jì)。Beegsson等(1999)研究表明，游離脂肪酸發(fā)揮它們對細(xì)菌生物膜的抗菌效應(yīng)，因此細(xì)菌耐藥性出現(xiàn)的幾率是不太可能的。Kabara(1978)和Monk等(1996)也報(bào)道與革蘭氏陽性菌相比，革蘭氏陰性菌對脂肪酸的抗菌作用不太敏感?？傊了釋υ谙蘧u蟲無節(jié)幼體培養(yǎng)基中攻毒的哈維氏弧菌和副溶血性弧菌的抗菌作用歸功于它是中鏈長度。更進(jìn)一步的是，本研究結(jié)果為辛酸可以作為一種抗生素替代品替代或者輔助抗生素治療水產(chǎn)養(yǎng)殖中發(fā)生的發(fā)光弧菌病提供判斷依據(jù)。