以濾紙酶活力為指標(biāo)優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071001）

地球上每年通過光合作用產(chǎn)生約5×1010t的纖維素，采用生物酶法將纖維素降解成簡單糖類，飼喂畜禽，可有效緩解“人畜爭糧”的現(xiàn)象，將具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會價值，但是大面積應(yīng)用需要消耗大量的纖維素酶。通過篩選產(chǎn)纖維素酶的優(yōu)良菌株以及優(yōu)化產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵工藝可有效提高纖維素酶產(chǎn)量，降低其應(yīng)用成本。

鑒于芽孢桿菌增殖速度快、發(fā)酵周期短、適合大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)良生產(chǎn)特性，目前產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的篩選及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化已成為發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶研究的熱點(diǎn)。Kazemi[1]從伊朗Fars省的土壤中分離篩選得到了1株產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌屬菌株BCCS A3，采用響應(yīng)面法對其培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，利用發(fā)酵罐系統(tǒng)達(dá)到了較高的產(chǎn)纖維素酶水平（50.30 U/ml），發(fā)現(xiàn)碳源、氮源在該菌株產(chǎn)纖維素酶過程中起到關(guān)鍵作用。王全等[2]以牛糞為原料篩選出對纖維素具有顯著降解活性的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株XN-13，酶活力達(dá)1 700 U/ml。張立靜等[3]從菜地土壤、動物糞便、青貯飼料等樣品中分離篩選出1株具有顯著的纖維素降解能力的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）菌株T-7，其纖維素酶活力達(dá)1 678.89 U/ml，通過降解工藝的優(yōu)化，最終以10億活菌/kg的接種量接入玉米秸稈，添加2%蔗糖+2%尿素，在發(fā)酵8 d后對秸稈纖維素的降解率達(dá)40.34%。楊麗娜等[4]從腐爛秸稈與腐殖質(zhì)土壤樣品中篩選到1株纖維素酶活性高的芽孢桿菌屬菌株NP29，該菌株在37℃、pH值7.0的條件下，發(fā)酵36 h后纖維素酶活性可達(dá)1.8 U/ml。孫宏等[5]采用Plackett-Burman設(shè)計研究8種培養(yǎng)因素對Z-4菌體生長的影響，經(jīng)最陡爬坡試驗和中心組合設(shè)計得到最佳培養(yǎng)條件，相應(yīng)條件下Z-4細(xì)胞干質(zhì)量濃度的最大值為5.39 g/l，較優(yōu)化前提高23.48%。孟婷等[6]以水牛瘤胃內(nèi)容物及糞便為材料，用羧甲基纖維素平板初篩及剛果紅染色法復(fù)篩，篩選出1株高產(chǎn)纖維素酶的革蘭氏陽性芽孢桿菌菌株CP-10；在1.0%麩皮、1.0%蛋白胨、初始pH值6.0、37℃的條件下，其產(chǎn)酶量最高，能夠在6 h內(nèi)崩解濾紙，羧甲基纖維素酶活（CMCase）可達(dá)16.8 U/ml。

本實驗室在前期工作中得到1株高產(chǎn)纖維素酶解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Tu-115，并對其最適產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件進(jìn)行了研究[7]，在最優(yōu)發(fā)酵條件下，CMC酶和濾紙酶活力分別可達(dá)73.35 IU/g和64.06 IU/g。本研究以濾紙酶活力為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗相結(jié)合的方法，考察培養(yǎng)基中碳源、氮源、起始pH值、裝瓶量、溫度、接種量、發(fā)酵時間等發(fā)酵條件對產(chǎn)酶能力的影響，對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶液體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最優(yōu)的液體發(fā)酵條件，為利用該菌株工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗儀器

ZHWY-2112B型雙層搖床，上海智誠分析儀器有限公司；GL-20G-II型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭試驗儀器總廠；MLS-3020型高壓滅菌鍋，SANYO公司；AIR TECH超凈工作臺，蘇凈集團(tuán)安泰公司制造廠；DH5000AB電熱恒溫培養(yǎng)箱，寧波海曙賽征試驗儀器廠；Adventurer電子天平，OHAUS USA；722-E型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.1.2 試驗菌株

Tu-115菌株，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院制藥工程系提供。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑

Mandel′s無機(jī)鹽營養(yǎng)液、DNS試劑制備方法參照尚偉等(2012)[7]。

芽孢桿菌種子培養(yǎng)基：蛋白胨2 g、蔗糖2 g、Man?del′s無機(jī)鹽營養(yǎng)液100 ml，自然pH值。

1.2 試驗方法

1.2.1 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶活性的測定

采用3,5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測定纖維素酶的濾紙酶活力。

葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法參照尚偉等(2012)[7]。

搖床發(fā)酵培養(yǎng)后，取下錐形瓶后取1 ml發(fā)酵液加入EP管中，12 000 r/min離心5 min，取上清液作為測定酶比活力用。測定方法參照尚偉等(2012)[7]。

每1 min催化濾紙水解生成1 μg葡萄糖的酶量為1個濾紙酶活力單位（U）。

1.2.2 Tu-115菌株種子液培養(yǎng)

將菌種用5 ml無菌蒸餾水從1支斜面培養(yǎng)基上沖洗下來，接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，裝瓶量為100 ml/250 ml。于180 r/min、37℃，搖床培養(yǎng)12 h后使用。

1.2.3 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)基組成及條件研究

每個試驗均設(shè)3個平行，最后取平均值。

1.2.3.1 碳源對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

分別以葡萄糖、麩皮、蔗糖、淀粉、羧甲基纖維素鈉、玉米粉作為碳源，含量均為2.0 g；2.0 g蛋白胨為氮源；100 ml Mandel′s無機(jī)鹽營養(yǎng)液，配制成6種不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，將2.0 ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24 h，而后進(jìn)行OD值測定。

1.2.3.2 氮源對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

根據(jù)上述試驗確定碳源種類，稱取2.0 g。分別以尿素、NH4Cl、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3、蛋白胨、酵母膏和黃豆餅粉作為氮源，加入0.2 g。加入100 ml Mandel′s營養(yǎng)液，配制成8種不同的發(fā)酵培養(yǎng)基。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，將2.0 ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24 h，而后進(jìn)行OD值測定。

1.2.3.3 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗

根據(jù)上述試驗結(jié)果，稱取碳源、氮源，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)Mandel′s營養(yǎng)液pH值，之后取100 ml營養(yǎng)液加入。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，將2.0 ml種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃條件下培養(yǎng)24 h，而后進(jìn)行OD值測定。利用L9（34）正交表設(shè)計試驗進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。

1.2.3.4 裝瓶量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，按50、75、100、125 ml分別加入在250 ml的三角瓶按優(yōu)化出的培養(yǎng)基成分加入各培養(yǎng)基成分和Tu-115菌株種子液。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，將種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃條件下培養(yǎng)24 h，而后進(jìn)行OD值測定。

1.2.3.5 溫度對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，稱取適量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s營養(yǎng)液，配制成發(fā)酵液。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，將適量種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在25、28、30、35、37℃溫度環(huán)境中培養(yǎng)24 h，而后進(jìn)行OD值測定。

1.2.3.6 接種量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，稱取適量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s營養(yǎng)液，配制成發(fā)酵培養(yǎng)基。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，分別加入種子液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ml，培養(yǎng)適當(dāng)時間，而后進(jìn)行OD值測定。

1.2.3.7 發(fā)酵時間對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

根據(jù)上述試驗結(jié)果，稱取適量碳源、氮源，加入100 ml Mandel′s營養(yǎng)液，配制成發(fā)酵液。Tu-115菌株種子液培養(yǎng)12 h后，按最優(yōu)的體積比將種子液轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最優(yōu)的溫度下培養(yǎng)，從發(fā)酵24 h開始，每隔24 h抽樣進(jìn)行酶活測定，直至120 h，而后進(jìn)行OD值測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及種子發(fā)酵液的酶活力測定

DNS法測定葡萄糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=1.393 8x，線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 3，線性關(guān)系良好。利用DNS法測定Tu-115菌株種子液的濾紙酶活力，為（26.40±3.28）U/ml。

2.2 培養(yǎng)基組成對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶影響的測定

2.2.1 碳源對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

碳源種類對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響見圖1。試驗結(jié)果表明，Tu-115菌株利用不同的碳源生長，產(chǎn)生的纖維素酶量有很大差別，以葡萄糖為碳源時產(chǎn)酶量最高。故選擇葡萄糖為最優(yōu)碳源。

圖1 碳源種類對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.2 氮源種類對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

氮源種類對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響見圖2。結(jié)果表明，黃豆餅粉作為氮源時，濾紙酶活力最大，且黃豆餅粉價格便宜，故以黃豆餅粉作為最適氮源。

圖2 氮源種類對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.3 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基組成正交試驗

對發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗結(jié)果（見表1）進(jìn)行極差分析（見表2），可知各因素對產(chǎn)纖維素酶量的影響，從大到小依次為葡萄糖含量>黃豆餅粉含量>起始pH值，由各因素各水平的均值可知，培養(yǎng)基的最佳組成為：A2B3C2，即培養(yǎng)基的最佳組成為葡萄糖4%、黃豆餅粉3%、pH值4.0。

表1 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗方案及結(jié)果

表2 Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基組成正交試驗結(jié)果極差分析

2.2.4 裝瓶量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

利用DNS法測定裝瓶量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)裝瓶量為50 ml/250 ml時可獲得最大產(chǎn)酶活力。

2.2.5 溫度對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

利用DNS法測定溫度對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，37℃時產(chǎn)酶活力最高。

2.2.6 接種量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

利用DNS法測定接種量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，接種量為4%時，產(chǎn)濾紙酶活力較高。故接種量選擇4%。

圖3 裝瓶量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

圖4 溫度對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

圖5 接種量對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

2.2.7 發(fā)酵時間對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

利用DNS法測定發(fā)酵時間對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，發(fā)酵72 h產(chǎn)酶活力最高，因此以72 h作為最適發(fā)酵時間。

圖6 發(fā)酵時間對Tu-115菌株產(chǎn)纖維素酶的影響

3 結(jié)論與討論

對解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株Tu-115的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)培養(yǎng)條件為葡萄糖4%、豆餅粉3%、接種量4%，培養(yǎng)基起始pH值4.0、接種量4%、裝瓶量50 ml/250 ml，37℃發(fā)酵72 h時，發(fā)酵液中濾紙酶活力達(dá)到最高值，為3 309.90 U/ml；與種子發(fā)酵液中濾紙酶活力相比，提高了125倍，Tu-115菌株發(fā)酵產(chǎn)濾紙酶能力大大提高。

濾紙酶活力（FPase）是指以濾紙為底物來表征的纖維素酶總活力，反映的是纖維素酶組分協(xié)同作用的總效果，即FPase越高，纖維素酶總活力越高，故本研究以FPase作為評價指標(biāo)可以較好地表征纖維素酶的總活力。Wang等[8]以FPase為指標(biāo)，采用響應(yīng)面法對Fomitopsis palustris菌株產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行優(yōu)化，在最優(yōu)條件下發(fā)酵，F(xiàn).palustris菌株產(chǎn)FPase能力達(dá)到了較高的水平(130.45 FPU/ml)，但所需時間較長（8 d）。發(fā)酵時間長主要是由于霉菌的特性決定的，且霉菌不適合大規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)，不利于纖維素酶生產(chǎn)成本的較低。雖然Tu-115菌株產(chǎn)FPase能力稍低，但它作為解淀粉芽孢桿菌，適合大規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)，有利于較低纖維素酶生產(chǎn)成本。