紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶及酸性蛋白酶條件的優(yōu)化

王秋辰，王昌祿，陳勉華，王玉榮，李貞景

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶及酸性蛋白酶條件的優(yōu)化

王秋辰，王昌祿，陳勉華，王玉榮，李貞景

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457)

從8株紅曲霉中篩選出紅曲霉MQ7作為高產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶的供試菌株，采用固態(tài)發(fā)酵方法測(cè)定在不同發(fā)酵溫度、底物料液比、大米和麩皮比例條件下的產(chǎn)酶情況．利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶過(guò)程，確定該菌株產(chǎn)酶最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，底物料液比(g∶mL)20∶25，大米麩皮比例(g∶g)17∶3．在此條件下，糖化酶活力達(dá)1,641.69U/g，酸性蛋白酶活力達(dá)151.09U/g．同時(shí)研究了NaCl含量對(duì)紅曲霉酶活力的抑制作用，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到18.92%時(shí)，紅曲霉MQ7產(chǎn)糖化酶活力下降64.8%，酸性蛋白酶活力下降85.6%．

紅曲霉；面醬；糖化酶；酸性蛋白酶；發(fā)酵條件

紅曲是以大米為原料，經(jīng)紅曲霉(Monascus)發(fā)酵制成的一種紫紅色米曲，一直以來(lái)被認(rèn)為具有食用和藥用雙重功效．紅曲中的紅曲色素[1]作為天然、優(yōu)良的復(fù)合型食用色素，可以提供性能穩(wěn)定、安全性高和品種多樣的天然色素．部分紅曲霉可代謝產(chǎn)生較高的糖化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等酶類，在我國(guó)釀造微生物行業(yè)中占有重要地位，也可用于豆腐、魚(yú)蝦等高蛋白食品[2]．紅曲中還含有多種藥理活性物質(zhì)，如Monacolin K能夠治療高膽固醇血癥[3]；麥角固醇可防止嬰兒佝僂病，對(duì)促進(jìn)孕婦和老年人鈣、磷的吸收也有明顯的生理作用[4]；γ–氨基丁酸是穩(wěn)定的降血壓活性物質(zhì)，對(duì)低腎素高血壓患者有很好的降血壓效果[5]．

面醬是以小麥面粉為主要原料釀制的醬類[6]．面醬發(fā)酵過(guò)程的實(shí)質(zhì)是原料中的淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)在一定條件下，利用曲霉類微生物分泌的淀粉酶分解為糊精、麥芽糖及葡萄糖．該糖化作用在制曲階段已經(jīng)開(kāi)始進(jìn)行，在醬醅發(fā)酵期間更進(jìn)一步加強(qiáng)．同時(shí)，面粉中的少量蛋白質(zhì)也經(jīng)曲霉所分泌的蛋白酶的作用將其分解成為各種氨基酸，而使面醬又稍有鮮味，成為具有特殊滋味的產(chǎn)品．

目前，面醬釀造制曲多用米曲霉AS3.042，所產(chǎn)酶系單一，面醬的色、香、味不足．采用多菌種制曲與發(fā)酵，可以彌補(bǔ)米曲霉菌種[7]所產(chǎn)生的酶系不全的缺陷，使面醬中各種酶類的比例更趨合理．將紅曲應(yīng)用于面醬發(fā)酵中，利用其糖化酶和酸性蛋白酶活力較高的特點(diǎn)，可優(yōu)化面醬生產(chǎn)過(guò)程中的酶系組成；同時(shí)，紅曲霉代謝產(chǎn)生的紅色素能夠彌補(bǔ)面醬色澤偏褐色的缺點(diǎn)；此外，紅曲具有的諸多保健功能對(duì)提高面醬出品率、產(chǎn)品質(zhì)量及附加值具有重要意義．本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的部分紅曲霉進(jìn)行研究，篩選高產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶紅曲霉，研究紅曲霉固態(tài)發(fā)酵條件對(duì)紅曲產(chǎn)酶的影響，以期為紅曲應(yīng)用于面醬生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為改善面醬產(chǎn)品質(zhì)量提供更多的參考．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與培養(yǎng)基

紅曲霉MQ1、MQ2、MQ3、MQ4、MQ7、MQ8、MQ9、MQ11，天津科技大學(xué)食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種．

斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨20，硝酸鈉10，硫酸鎂5，磷酸二氫鉀10，瓊脂粉30，121℃滅菌20min．

種子液培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨20，硝酸鈉10，硫酸鎂5，磷酸二氫鉀10，121℃滅菌20min．

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：將大米與蒸餾水以1(g)∶1(mL)的比例浸泡過(guò)夜，分裝入250mL三角瓶中，每瓶20g原料，20mL蒸餾水，121℃滅菌20min．

1.1.2 試劑與儀器

福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；麩皮、大米，市售；硫酸鎂、硝酸鈉、冰乙酸、乙酸鈉、乳酸、乳酸鈉、磷酸二氫鉀，分析純，天津市化學(xué)試劑一廠．

電子天平，美國(guó)雙杰(兄弟)集團(tuán)有限公司；微電腦控制光照培養(yǎng)箱，珠江廣東省醫(yī)療器械廠；迴轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜，上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，KAGOSHIMA SEISAKUSHO公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)安捷倫科技有限公司．

1.2 酶活檢測(cè)

糖化酶活力測(cè)定采用斐林試劑滴定法，參照GB 8276—2006[8]，糖化酶活力單位定義：1g酶粉在40℃、pH 4.6的條件下，1h水解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為1個(gè)糖化酶活力單位，以U/g表示．

酸性蛋白酶活力測(cè)定采用福林酚方法，參照GB/T 23527—2009[9]，酸性蛋白酶活力單位定義：1g酶粉在40℃、pH 3.0條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1,μg酪氨酸，即為1個(gè)酸性蛋白酶活力單位，以U/g表示．

1.3 高產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶菌種的篩選

將紅曲霉MQ1、MQ2、MQ3、MQ4、MQ7、MQ8、MQ9、MQ11菌種分別接種到新鮮的斜面培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)6～8d后，在紅曲霉菌種斜面中加入5mL已滅菌的種子液培養(yǎng)基，制成孢子懸浮液，接種到裝有100mL種子液培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，30℃，180r/min培養(yǎng)24h，得到種子液，調(diào)整孢子數(shù)為2×106mL-1．將各菌株種子液分別加入已滅菌的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5mL，均勻加入，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第6天開(kāi)始每隔24h檢測(cè)糖化酶及酸性蛋白酶活力．

1.4 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

利用單因素實(shí)驗(yàn)，研究紅曲霉不同發(fā)酵溫度、底物料液比(大米和麩皮總質(zhì)量與蒸餾水體積間的比例)、大米麩皮質(zhì)量比對(duì)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵條件．

1.5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響

將測(cè)定糖化酶和酸性蛋白酶活力所用的乙酸–乙酸鈉緩沖液和乳酸–乳酸鈉緩沖液換成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為8.02%、10.15%、12.28%、14.47%、16.67%、18.92%的NaCl溶液，制備樣品稀釋液，比較NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)紅曲霉酶活力的影響．

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)糖化酶及酸性蛋白酶菌種的篩選

按照1.3所述方法篩選高產(chǎn)糖化酶及酸性蛋白酶的紅曲霉菌株，結(jié)果見(jiàn)圖1．將各菌株的最大酶活力進(jìn)行比較，按糖化酶活力排序?yàn)镸Q7＞MQ9＞MQ2＞MQ1＞MQ11＞MQ3＞MQ8＞MQ4，按酸性蛋白酶活力排序?yàn)镸Q7＞MQ9＞MQ8＞MQ1＞MQ11＞MQ4＞MQ3＞MQ2，其中MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力均最高，因此選擇MQ7作進(jìn)一步研究．

圖1 不同菌株的糖化酶和酸性蛋白酶最大活力對(duì)比Fig. 1 Contrast of maximum activities of glucoamylase and acid protease of different strains

2.2 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶的影響

在底物料液比20∶20，大米麩皮比例19∶1的條件下發(fā)酵7d，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2．

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響Fig. 2 Effect of fermentation temperature on glucoamylase and acid protease activities of Monascus MQ7

由圖2可見(jiàn)：發(fā)酵溫度對(duì)紅曲霉MQ7產(chǎn)酶活力有較大影響，在20～30℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高酶活力逐漸增大，在30℃時(shí)MQ7菌株代謝產(chǎn)生的糖化酶和酸性蛋白酶活力最高，分別達(dá)到1,432.6U/g和106.6U/g；高于30℃時(shí)，酶活逐漸降低，達(dá)到40℃時(shí)，酶活下降顯著．這是因?yàn)闇囟冗^(guò)高會(huì)抑制酶系充分發(fā)揮作用[10]，降低產(chǎn)酶活性，并且過(guò)高的溫度使得水分蒸發(fā)過(guò)快，造成紅曲霉在生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸缺水．綜上所述，選擇25、30、35℃作為正交實(shí)驗(yàn)的因素水平．

2.2.2 底物料液比對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵溫度30℃，大米麩皮比例19∶1條件下發(fā)酵7d，研究不同底物料液比對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3．

圖3 底物料液比對(duì)MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響Fig. 3Effect of substrate solid-liquid ratio on glucoamylase and acid protease activities of Monascus MQ7

由圖3可見(jiàn)：糖化酶產(chǎn)酶量隨著底物料液比的變化呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)．當(dāng)?shù)孜锪弦罕葹?0∶25時(shí)，紅曲霉MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力最高，分別達(dá)到1,198.3U/g和106.1U/g，相比底物料液比20∶20和20∶30有明顯增長(zhǎng)．合理料液比可以使培養(yǎng)基有較好的疏松性[11]，增加空氣傳遞，使菌體代謝產(chǎn)生的酶更好地傳輸，提高產(chǎn)物產(chǎn)量．水分含量過(guò)低，培養(yǎng)基中后期表面會(huì)逐漸干燥，喪失疏松性；水分含量過(guò)高，物料黏結(jié)，都不利于通風(fēng)和菌體生長(zhǎng)．綜上所述，確定底物料液比20∶20、20∶25、20∶30作為正交實(shí)驗(yàn)的因素水平．

2.2.3 大米麩皮比例對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶的影響

在發(fā)酵溫度30℃，底物料液比20∶25條件下發(fā)酵7d，研究不同大米麩皮比例對(duì)MQ7菌株產(chǎn)酶活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4．

圖4 大米麩皮比例對(duì)MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響Fig. 4Effect of proportion to rice to bran on glucoamylase and acid protease activities of Monascus MQ7

由圖4可見(jiàn)：當(dāng)大米麩皮比例為18∶2時(shí)，紅曲霉MQ7產(chǎn)糖化酶活力最高，達(dá)到1,754.4U/g，在大米麩皮比例為17∶3時(shí)，紅曲霉MQ7產(chǎn)酸性蛋白酶活力最高，達(dá)到127.8U/g．麩皮中含有較多的淀粉、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等，同時(shí)麩皮還能夠保證培養(yǎng)基的疏松程度[12]．糖化酶和酸性蛋白酶活力隨大米與麩皮比例的減小而先增高后降低，這可能與大米和麩皮中組分含量不同，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分利用難易程度不同有關(guān)．綜上所述，選擇19∶1、18∶2、17∶3作為正交實(shí)驗(yàn)的因素水平．

2.2.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇影響產(chǎn)酶活力的發(fā)酵溫度(A)、底物料液比(B)、大米麩皮比例(C)3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，以糖化酶和酸性蛋白酶活力為指標(biāo)進(jìn)行結(jié)果分析，考察各因素的影響程度．正交實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2．

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab. 1Factors and levels of orthogonal experiments for optimization of fermentation

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab. 2 Result of orthogonal experiments for optimization of fermentation

由表2可知，各因素對(duì)糖化酶活力影響程度為C＞B＞A，根據(jù)糖化酶活力確定的最優(yōu)組合為A2B2C3.各因素對(duì)酸性蛋白酶活力的影響程度為C＞A＞B，根據(jù)酸性蛋白酶活力確定最優(yōu)組合為A1B2C3．

通過(guò)綜合平衡法[13]確定紅曲霉MQ7固態(tài)發(fā)酵最佳條件為A2B2C3，即發(fā)酵溫度30℃，底物料液比20∶25，大米麩皮比例17∶3．

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析，其結(jié)果見(jiàn)表3、表4．

表3 MQ7菌株糖化酶發(fā)酵條件優(yōu)化方差分析Tab. 3 Variance analysis of orthogonal experiments for optimization of glucoamylase

表4 MQ7菌株酸性蛋白酶發(fā)酵條件優(yōu)化方差分析Tab. 4Variance analysis of orthogonal experiments for optimization of protease

由表3可知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，大米麩皮比例對(duì)糖化酶活力有顯著影響．

由表4可知，在95%置信區(qū)間內(nèi)，3個(gè)因素對(duì)酸性蛋白酶活力的影響不顯著，但均對(duì)酸性蛋白酶活力有一定影響．

2.2.5 結(jié)果驗(yàn)證

MQ7菌株產(chǎn)酸性蛋白酶的最佳組合A1B2C3并未出現(xiàn)在正交表中，所以在此最佳組合條件下進(jìn)行3次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)．結(jié)果表明，MQ7菌株產(chǎn)酸性蛋白酶活力分別為155.11、155.32、156.42U/g，平均值為155.62U/g，與實(shí)驗(yàn)組合A2B2C3得到的MQ7菌株代謝產(chǎn)生酸性蛋白酶酶活151.09U/g相差僅3.0%，而實(shí)驗(yàn)組合A2B2C3為MQ7菌株產(chǎn)糖化酶的最優(yōu)組合，酶活力為1,641.69U/g，因此，選取A2B2C3為正交實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)組合．

2.3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl溶液代替緩沖液對(duì)紅曲霉MQ7酶活力的影響見(jiàn)圖5．

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)MQ7產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶活力的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of brine on glucoamylase and protease activities of Monascus MQ7

由圖5可見(jiàn)：隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，糖化酶及酸性蛋白酶的酶活均有一定程度的降低．不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶活降低程度不同，總體來(lái)說(shuō)，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，對(duì)酶的抑制作用越大．當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到18.92%時(shí)，糖化酶活力下降64.8%，酸性蛋白酶活力下降85.6%．糖化酶和蛋白酶活力是鑒定面醬發(fā)酵中菌種好壞的重要指標(biāo)[14]，由于面醬發(fā)酵中的NaCl主要起著調(diào)節(jié)口感和防腐作用，因此實(shí)際生產(chǎn)中一般控制NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%左右，在盡量保證較大酶活力的同時(shí)，保證面醬風(fēng)味，防止腐敗．

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從8株紅曲霉中篩選出高產(chǎn)糖化酶及酸性蛋白酶的MQ7為供試菌株．通過(guò)單因素及正交實(shí)驗(yàn)研究紅曲霉MQ7固態(tài)發(fā)酵過(guò)程，確定最佳產(chǎn)糖化酶和酸性蛋白酶培養(yǎng)條件為：發(fā)酵溫度30℃，底物料液比(g∶mL)20∶25，大米麩皮比例(g∶g)17∶3．利用NaCl溶液代替緩沖液提取粗酶液，隨NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，對(duì)酶活力的抑制作用越來(lái)越大，在面醬實(shí)際生產(chǎn)中考慮口感等因素應(yīng)控制NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%左右．

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責(zé)任編輯：常濤

Optimization of Fermentation Conditions of Glucoamylase and Acid Protease Production with Monascus in Solid-state Fermentation

WANG Qiuchen，WANG Changlu，CHEN Mianhua，WANG Yurong，LI Zhenjing

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Monascus MQ7 strain was obtained from eight Monascus strains as the highly glucuoamylase and acid protease producing strain. The solid-state fermentation conditions for the glucoamylase and acid protease production with Monascus MQ7 were studied. Based on single factor tests，in different fermentation temperature，substrate solid-liquid ratio，proportion of rice and bran，the glucoamylase and acid protease production conditions were optimized with L9(34)orthogonal test. The results are as follows：the fermentation temperature is 30℃，substrate solid-liquid ratio(g∶mL)20∶25，and the proportion of rice to bran(g∶g)17∶3. Under the above conditions，the glucoamylase activity reached 1,641.69U/g，and the highest acid protease activity reached 151.09U/g. The inhibition of NaCl on enzyme activity was also verified. When the NaCl mass fraction reached 18.92%，Monascus MQ7glucoamylase activity decreased 64.8%，and acid protease activity decreased 85.6%.

Monascus；flour paste；glucoamylase；acid protease；fermentation condition

TS264

A

1672-6510(2014)04-0021-05

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.04.005

2013–12–23；

2014–02–27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171729)

王秋辰（1988—），女，天津人，碩士研究生；通信作者：王昌祿，教授，clw123@tust.edu.cn.