熒光光譜法研究頭孢孟多脂與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里,彭洪生,伏云紅

（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011）

熒光光譜法研究頭孢孟多脂與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里,彭洪生,伏云紅

（曲靖師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，云南 曲靖 655011）

模擬生理?xiàng)l件下，用熒光光譜法和紫外-可見(jiàn)吸收光譜法研究頭孢孟多酯和牛血清白蛋白（BSA）結(jié)合反應(yīng)的特征。研究表明：頭孢孟多酯與BSA形成復(fù)合物，從而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，該過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程。根據(jù)Stern-Volmer方程得出不同溫度下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)Ka；結(jié)合位點(diǎn)位于BSA的亞結(jié)構(gòu)IIA中。通過(guò)計(jì)算相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，確定頭孢孟多酯與BSA之間的作用力主要為靜電作用力。利用同步熒光光譜探討了頭孢孟多酯與BSA作用前后白蛋白的構(gòu)型變化。Hill系數(shù)nH＜1，表明頭孢孟多酯有弱的負(fù)協(xié)同作用。此研究不僅對(duì)于揭示體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)問(wèn)題和指導(dǎo)臨床合理用藥具有一定意義，而且對(duì)藥物分子設(shè)計(jì)及新藥開(kāi)發(fā)等也具有重要指導(dǎo)意義。

頭孢孟多酯；牛血清白蛋白；熒光光譜法；紫外-可見(jiàn)吸收光譜法

0 引 言

近年來(lái)采用熒光光譜法研究藥物和蛋白質(zhì)的相互作用已成為生命科學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是結(jié)構(gòu)剖析比較成熟的蛋白質(zhì)[1-2]，是各學(xué)科研究蛋白質(zhì)與小分子相互作用的對(duì)象。頭孢孟多酯（cefamandole，CEF）為第二代頭孢菌素類(lèi)抗生素，對(duì)白喉?xiàng)U菌和革蘭陽(yáng)性厭氧菌（厭氧球菌和梭狀芽孢

桿菌）均有良好作用，對(duì)大腸埃希菌、奇異變形桿菌、肺炎克雷伯菌和流感嗜血桿菌的活性較頭孢噻吩和頭孢唑林為強(qiáng)[3]。目前，分子光譜法研究藥物小分子與生物大分子的相互作用已有報(bào)道[4-5]，但尚未見(jiàn)CEF與BSA相互作用的研究。本文采用光譜法研究CEF與BSA的相互作用，提供一些重要的信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），測(cè)定參數(shù)：狹縫寬度5.0nm，光電倍增管（PMT）負(fù)電壓為700V；Cary 50型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安技術(shù)中國(guó)有限公司）；pHS-3C精密酸度計(jì)（上海虹益儀器儀表有限公司）。超級(jí)恒溫水浴鍋（DHG-9035A型，上海一恒科技有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA，上?？瑯由锛夹g(shù)有限公司）配制成濃度為1.0×10-4mol/L的水溶液；頭孢孟多脂（CEF，87.3%中國(guó)藥品生物制品檢定所）配制成濃度為8.73×10-4mol/L；并保存于0～4℃的冰箱中。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

于10.0 mL比色管中依次加入不同體積的8.73×10-5mol/L的CEF溶液，1.0×10-6mol/L的BSA 2.5mL，0.2mol/L、pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液2mL；0.5 mol/LNaCl溶液2.0 mL以保持反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度；用水釋至刻度并搖勻，放置50min。熒光分光光度計(jì)記錄熒光光譜，其最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)（λex/λem）位于280nm/340nm處，于1cm石英池中分別測(cè)量反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度F及試劑空白的熒光強(qiáng)度F0，ΔF=F0-F。固定熒光發(fā)射與激發(fā)的波長(zhǎng)差分別為Δλ=15nm和Δλ=60nm，掃描同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

圖1是按照實(shí)驗(yàn)方法改變CEF濃度時(shí)的BSA熒光發(fā)射光譜圖，可以看出隨著CEF濃度的增大，BSA的熒光強(qiáng)度有規(guī)律地猝滅，表明CEF與BSA之間發(fā)生了相互作用。

2.2 適宜的反應(yīng)條件

分別考察了不同緩沖溶液、pH、緩沖溶液的用量、BSA的濃度、試劑加入順序以及反應(yīng)時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)選用pH=7.40的Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL調(diào)節(jié)酸度，2.5×10-7mol/L BSA作為反應(yīng)濃度，BSA→CEF→Tris-HCl→NaCl的加入順序以及溶液放置50min后ΔF基本保持穩(wěn)定達(dá)到且最大，因此實(shí)驗(yàn)按照優(yōu)化出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行熒光測(cè)量。

2.3 BSA與CEF的結(jié)合反應(yīng)

圖1 頭孢孟多脂與BSA的熒光光譜

2.3.1 熒光猝滅機(jī)理

熒光猝滅機(jī)理有動(dòng)態(tài)、靜態(tài)和靜態(tài)動(dòng)態(tài)混合猝滅3種[6]。動(dòng)態(tài)猝滅遵從Stern-Volmer方程[7-8]：

式中：Kq——雙分子猝滅過(guò)程的速率常數(shù)；

Ksv——Stern-Volmer猝滅常數(shù)；

[Q]——猝滅劑濃度。

猝滅過(guò)程若為靜態(tài)猝滅，熒光強(qiáng)度與猝滅劑濃度之間的關(guān)系可適用于改進(jìn)的Stern-Volmer方程[7-8]：

式中：K——配合物的形成常數(shù)。

但在某些情況下靜態(tài)猝滅與動(dòng)態(tài)猝滅可能同時(shí)存在，混合猝滅Stern-Volmer曲線向上彎曲[7-8]。

為了確定熒光猝滅機(jī)理的類(lèi)型，按照實(shí)驗(yàn)方法在286，296，306 K時(shí)，測(cè)定不同濃度CEF下BSA的相對(duì)熒光強(qiáng)度，并作F0/F-[Q]圖，結(jié)果見(jiàn)表1。Stern-Volmer曲線均呈良好的線性關(guān)系，表明CEF對(duì)BSA的熒光猝滅機(jī)理不是靜態(tài)動(dòng)態(tài)混合猝滅。

表1 Stern-Volmer線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

通常認(rèn)為各類(lèi)猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)為2.0×1010L/（mol·s）[8]。從表1可知，Kq遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于2.0×1010L/（mol·s），可判斷該熒光猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅。且表1顯示隨著溫度升高Ksv減小，也表明該過(guò)程是靜態(tài)猝滅。

若猝滅過(guò)程為靜態(tài)猝滅，則應(yīng)符合Lineweaver-Burk方程[8]：

式中：KLB——靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù)。

（F0-F）-1-[Q]-1作不同溫度下的Lineweaver-Burk曲線，結(jié)果表明CEF與BSA結(jié)合作用較強(qiáng)（見(jiàn)表2）。同時(shí)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)該直線具有良好的線性關(guān)系，說(shuō)明CEF與BSA的作用更符合靜態(tài)猝滅的特征。

表2 Lineweaver-Burk線性回歸方程的相關(guān)參數(shù)

圖2 頭孢孟多脂與牛血清白蛋白混合溶液的紫外示差吸收光譜

2.3.2 紫外吸收光譜

圖2為加入CEF前后BSA熒光光譜的變化情況?？梢钥闯?，隨著CEF濃度的增加，BSA的最大吸收的吸光度明顯增大，并且最大吸收峰從280nm處紅移至285nm處，可以推斷基態(tài)的BSA與CEF之間一定發(fā)生了相互作用。在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的配合物，從而引起B(yǎng)SA紫外吸收光譜的變化。由于動(dòng)態(tài)猝滅只影響熒光分子的激發(fā)態(tài)，并不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜[8]，進(jìn)一步證明猝滅過(guò)程是由靜態(tài)猝滅引起的。

2.3.3 結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)

設(shè)生物大分子有n個(gè)相同且獨(dú)立的結(jié)合位置，可以通過(guò)公式推導(dǎo)得到方程[8-10]：

以lg[（F0-F）/F]對(duì)lg[Q]作286，296，306K的圖，可求出藥物分子與蛋白質(zhì)分子作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n。所得結(jié)果列于表3。所得數(shù)據(jù)表明，CEF與BSA有一定的結(jié)合能力，可形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，能在體內(nèi)被蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)。并且隨著溫度的升高，Ka減小，進(jìn)一步驗(yàn)證了靜態(tài)猝滅的機(jī)理。

2.3.4 熱力學(xué)參數(shù)與結(jié)合力類(lèi)型

Ross等[10]總結(jié)出小分子與生物大分子反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力類(lèi)型的關(guān)系，ΔH＜0，ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用力。因此，表4的數(shù)據(jù)表明，CEF與BSA之間的主要作用力是靜電作用力。

表3 頭孢孟多脂與BSA的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

表4 不同溫度下CEF與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.4 結(jié)合位置的確定

Sulkowska等[11-13]認(rèn)為比較激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm和295nm時(shí)的BSA的熒光猝滅光譜，可以了解酪氨酸殘基和色氨酸殘基在藥物分子與BSA的結(jié)合反應(yīng)中的參與情況，并確定其結(jié)合的具體位置[12]。由圖3可知，在激發(fā)波長(zhǎng)為280nm和295nm時(shí)，CEF對(duì)BSA的猝滅曲線沒(méi)有重疊，且在280nm時(shí)的蛋白熒光猝滅比295nm時(shí)的猝滅程度大，表明在CEF與BSA的反應(yīng)中色氨酸和酪氨酸殘基均參加了作用。進(jìn)而可以確定，CEF與BSA的結(jié)合位點(diǎn)主要位于亞結(jié)構(gòu)域IIA。

圖3 λex為280nm和295nm時(shí)，CEF與BSA作用的相對(duì)熒光猝滅曲線

2.5 藥物協(xié)同性

按照文獻(xiàn)[13-14]的方法計(jì)算CEF-BSA的nH值，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表5。各溫度下的nH均小于1，說(shuō)明CEF-BSA結(jié)合過(guò)程中，隨著配體CEF不斷結(jié)合到結(jié)合位點(diǎn)上，導(dǎo)致后繼配體對(duì)BSA的親和性有所降低，表現(xiàn)為負(fù)協(xié)同作用。

2.6 頭孢孟多脂對(duì)BSA構(gòu)象的影響

由于蛋白質(zhì)中酪氨酸、色氨酸殘基的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，因此，根據(jù)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)的改變可判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。按實(shí)驗(yàn)方法，固定BSA的濃度，逐漸增加CEF的濃度，分別在Δλ=15nm和Δλ=60nm，測(cè)得頭孢孟多脂猝滅BSA的同步熒光光譜如圖4所示。

表5 不同溫度時(shí)各體系的Hill系數(shù)nH

可以看出，隨CEF濃度的增大，Δλ=15nm酪氨酸和Δλ=60nm色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)均有紅移，表明CEF與BSA作用改變了色氨酸、酪氨酸殘基所處的微環(huán)境。氨基酸微環(huán)境的改變使得BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性減弱[13-15]，從而導(dǎo)致BSA的構(gòu)象發(fā)生了變化。高濃度藥物使蛋白質(zhì)分子伸展，降低了氨基酸殘基間的能量傳遞，使兩者的熒光強(qiáng)度降低。

3 結(jié)束語(yǔ)

采用熒光光譜法和紫外-可見(jiàn)吸收光譜法研究頭孢孟多酯和牛血清白蛋白結(jié)合反應(yīng)的特征。研究表明：CEF與BSA形成復(fù)合物，從而猝滅BSA的內(nèi)源性熒光，該過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程。根據(jù)Stern-Volmer方程得出了不同溫度下結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)；結(jié)合位點(diǎn)位于BSA的亞結(jié)構(gòu)IIA中。通過(guò)計(jì)算相應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)，確定了CEF與BSA之間的作用力主要為靜電作用力。利用同步熒光光譜探討了CEF與 BSA作用前后白蛋白的構(gòu)型變化。Hill系數(shù)nH＜1，表明CEF有弱的負(fù)協(xié)同作用。研究不僅可以獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及其分布情況等信息，還有助于從分子水平上揭示藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合特性，這對(duì)于了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝過(guò)程、闡明藥物的作用機(jī)制及生物大分子與藥物小分子相互作用的化學(xué)本質(zhì)，從而為指導(dǎo)臨床用藥和藥物分子設(shè)計(jì)均具有較大意義。

圖4 頭孢孟多脂猝滅BSA的同步熒光光譜圖

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Study on interaction between cefamandole and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy

LIU Li，PENG Hong-sheng，F(xiàn)U Yun-hong
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Qujing Normal University，Qujing 655011，China）

The interaction between cefamandole and bovine serum albumin（BSA）was studied with fluorescence spectra and UV-visible absorption spectra in the presence of simulating physiological systems.It showed that the complex for mated by BSA and cefamandole lead to the static quenching of the intrinsic fluorescence of BSA.The binding site numbernand apparent binding constant Ka were measured according to the Stern-Volmer equation.The primary binding site for cefamandole was located at site I in subdomain IIA of BSA.The author also confirmed that the main sorts ofbinding force between cefamandole and BSA was the electro-static force. Meanwhile，synchronous fluorescence was used to investigate the structure change of BSA before and after the introduction of cefamandole.The values of Hill’s coefficients were less than 1，which indicated that there was some negative cooperative effect.It is not only valuable to reveal the pharmacokinetics， clinicaltherapy， butalso guiding significance for drug design and development of new drugs.

cefamandole；bovine serum albumin；fluorescence spectroscopy；UV-visible absorption spectra

R961；O657.31；R927；R978.1+1

：A

：1674-5124（2014)03-0064-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.03.018

2013-06-17；

：2013-08-29

云南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2009CD095）

劉 里（1982-），女，吉林省吉林市人，講師，碩士，主要從事納米材料和分子發(fā)光學(xué)理論與應(yīng)用研究。