黃體酮凝膠劑的刺激性和子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究

王　梅，侯艷霞，常占瑛，賀　冰，周雪峰（.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 8300；.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

黃體酮凝膠劑的刺激性和子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)研究

王梅1，侯艷霞1，常占瑛1，賀冰2，周雪峰1（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830000）

目的：研究黃體酮凝膠劑陰道給藥后的刺激性及其對(duì)子宮內(nèi)膜Mcphail指數(shù)的影響，初步考察藥效，探討黃體酮凝膠劑的制劑可行性。方法：選取雌性未孕未產(chǎn)普通家兔20只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組，每組各4只。除空白對(duì)照組和空白基質(zhì)組外，其余各組分別給予不同劑量黃體酮凝膠劑，考察黃體酮凝膠劑單次和多次給藥后的陰道刺激性。在此基礎(chǔ)上，采用子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)黃體酮凝膠劑對(duì)家兔子宮的作用。結(jié)果：?jiǎn)未位蚨啻谓o藥后，與空白對(duì)照組相比，各組家兔均未出現(xiàn)明顯的紅斑、分泌物滲出。病理切片結(jié)果表明，單次或多次給藥后，各組病理結(jié)果無(wú)明顯差異。藥效學(xué)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)23 d給藥，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組，陽(yáng)性對(duì)照組的Mcphail分級(jí)結(jié)果分別為（0.25±0.46）、（1.00±0.61）、（1.75±0.50）、（2.25±0.50）、（3.20±0.27）；子宮病理切片結(jié)果顯示低、中、高劑量組子宮逐漸由增生期向分泌期轉(zhuǎn)變。結(jié)論：黃體酮凝膠劑單次或多次給藥后，對(duì)家兔陰道和子宮無(wú)明顯刺激性，Mcphail分級(jí)顯示黃體酮凝膠劑具有一定的孕激素活性，能促進(jìn)家兔子宮內(nèi)膜發(fā)育，表明該劑型具有一定的制備可行性。

黃體酮；凝膠劑；刺激性；子宮內(nèi)膜

黃體酮（progesterone）是由卵巢黃體分泌的一種天然孕激素，在臨床中應(yīng)用廣泛，可用于治療繼發(fā)性閉經(jīng)、機(jī)能不良性出血、黃體期支持、早產(chǎn)、黃體功能不全、經(jīng)前綜合征等，在激素補(bǔ)充療法中，可防止長(zhǎng)期服用雌激素所引起的子宮內(nèi)膜增生，降低因單用雌激素所引起的絕經(jīng)后婦女患子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)，且能更好的預(yù)防骨質(zhì)疏松與牙周疾病[1-2]。

然而天然黃體酮存在口服后吸收差，具有較強(qiáng)的首過(guò)效應(yīng)，生物利用度低的缺點(diǎn)，極大地限制了臨床應(yīng)用。黃體酮在臨床上常用劑型為注射劑，由于注射劑是油溶液，注射后疼痛，而且黃體酮在激素補(bǔ)充療法中需要長(zhǎng)期給藥，肌注給藥患者的順應(yīng)性較低，所以提高黃體酮的生物利用度，開(kāi)發(fā)黃體酮新型制劑，已成為黃體酮應(yīng)用中的關(guān)鍵問(wèn)題[3-4]。針對(duì)這一問(wèn)題，本課題組研制了黃體酮凝膠劑，并對(duì)其陰道給藥的初步藥效進(jìn)行了考察，為開(kāi)發(fā)黃體酮凝膠劑提供參考。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器與試劑

黃體酮凝膠劑（新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑教研室，含量為0.3%，g/g）；黃體酮注射液（浙江仙琚制藥股份有限公司，規(guī)格1 mg : 10 mL，批號(hào)130217）；10%甲醛溶液為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性未孕未產(chǎn)普通家兔40只，體質(zhì)量1.5 ～ 2 kg；新西蘭雌性幼兔44只，體質(zhì)量0.8 ～ 1.2 kg，均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（新）2011-0003。

2　方法

2.1黃體酮凝膠劑單次給藥后的陰道用藥刺激性考察[5-7]

雌性未孕未產(chǎn)普通家兔20只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組，每組各4只。給藥劑量按臨床中黃體酮注射液的人用劑量推算至兔給藥劑量作為中劑量組給藥劑量，再根據(jù)黃體酮凝膠劑中含黃體酮量（0.3%，g/g）和家兔的體重推算至每只家兔應(yīng)給予的黃體酮凝膠劑的劑量。低、中、高各劑量組給予黃體酮凝膠劑的用量分別為1.725、3.450、6.900 mg·kg-1，空白基質(zhì)組按中劑量組對(duì)應(yīng)的凝膠劑量給予空白凝膠劑。

稱(chēng)重后，將藥物和賦形劑用自制給藥管插入家兔陰道內(nèi)長(zhǎng)度約7 cm，采用注射劑將凝膠劑經(jīng)由導(dǎo)管緩緩?fù)迫耄缓笤诮o藥1、24、48、72 h分別觀(guān)察動(dòng)物進(jìn)食、活動(dòng)情況和陰道部位有無(wú)紅斑、水腫、分泌物等。按照藥理實(shí)驗(yàn)陰道刺激性肉眼觀(guān)察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)和藥物對(duì)陰道刺激性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[8]對(duì)各組刺激性情況進(jìn)行評(píng)分。72 h后將家兔處死，取陰道和子宮組織，剪開(kāi)后平鋪于濾紙上，吸干水分然后置于10%甲醇溶液固定24 h，HE染色后做病理切片檢查。

2.2黃體酮凝膠劑多次給藥后的陰道刺激性考察

雌性未孕未產(chǎn)普通家兔20只，隨機(jī)分成空白對(duì)照組，空白基質(zhì)組，低、中和高劑量組，每組各4只。給藥劑量計(jì)算同“2.1”項(xiàng)下，黃體酮凝膠劑低、中、高各劑量組分別給予的劑量為1.725、3.450、6.900 mg·kg-1，空白基質(zhì)組按中劑量組對(duì)應(yīng)的凝膠劑量給予空白凝膠劑。

依照單次給藥方法連續(xù)給藥10 d，第1、5、10天分別稱(chēng)重，第10天給藥后繼續(xù)觀(guān)察24、48、72 h，記錄家兔陰道黏膜狀況（有無(wú)紅斑、水腫、分泌物等），同“2.1”項(xiàng)下方法對(duì)刺激性進(jìn)行評(píng)分。72 h后將家兔處死，取陰道和子宮組織，HE染色后進(jìn)行病理切片檢查。

2.3子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[9-11]

采用兔子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，測(cè)定兔子宮內(nèi)膜腺體增生程度，采用Mcphail評(píng)分法測(cè)定孕激素的活性。將新西蘭雌性幼兔40只，隨機(jī)分為空白基質(zhì)組，陽(yáng)性對(duì)照組，低、中、高劑量組，每組各8只，另取4只未給藥幼兔作為空白對(duì)照組。給藥劑量同“2.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，低、中、高劑量組分別給予3.450、6.900、13.800 mg·kg-1黃體酮凝膠，空白基質(zhì)組按6.900 mg·kg-1給予不含藥的空白凝膠劑，陽(yáng)性對(duì)照組以黃體酮注射液作為陽(yáng)性對(duì)照，以13.800 mg·kg-1肌肉注射給藥，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組連續(xù)陰道給藥23 d，第1、23天分別稱(chēng)重，第24天處死。陽(yáng)性對(duì)照組連續(xù)給藥10 d，第11天稱(chēng)重后處死。幼兔處死后，取部分子宮組織（自子宮與陰道連接處向卵巢方向用直尺量2 cm處），剪開(kāi)平鋪于濾紙上，吸干水分，置于10%甲醇溶液中固定24 h，HE染色后，做病理切片檢查。根據(jù)內(nèi)膜腺體增生程度，按Mcphail指數(shù)分級(jí)，Mcphail指數(shù)從0級(jí)到4級(jí)表示孕酮樣反應(yīng)依次增強(qiáng)，比較各組Mcphail指數(shù)的差異。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間比較采用q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3　結(jié)果

3.1黃體酮凝膠劑單次陰道用藥刺激性實(shí)驗(yàn)

各組刺激性評(píng)分結(jié)果詳見(jiàn)表1，結(jié)果顯示與空白對(duì)照組相比，空白基質(zhì)組出現(xiàn)少量分泌物；低劑量組紅斑和水腫出現(xiàn)頻率較高；中、高劑量組的家兔基本無(wú)紅斑和水腫，高劑量組具有很少量的分泌物。這表明黃體酮凝膠劑單次陰道給藥有輕微的刺激性，而低劑量組紅斑和水腫高于中、高劑量組，其原因可能是個(gè)體差異。病理切片結(jié)果詳見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，各組家兔陰道上皮黏膜未見(jiàn)脫落，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮內(nèi)膜未發(fā)生變化。

3.2黃體酮凝膠劑多次陰道用藥刺激性實(shí)驗(yàn)

各組刺激性評(píng)分結(jié)果詳見(jiàn)表2，由結(jié)果可知與空白對(duì)照組相比，空白基質(zhì)組，低、中、高劑量組在給藥10 d后出現(xiàn)輕度的紅斑和水腫，未見(jiàn)明顯分泌物。病理切片結(jié)果顯示各組均未出現(xiàn)明顯上皮細(xì)胞脫落及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，各組病理切片結(jié)果無(wú)明顯差異（見(jiàn)圖2）。

表1　單次給藥后家兔陰道黏膜刺激性評(píng)分觀(guān)察結(jié)果. n = 20Tab 1　Vaginal irritation score results of rabbits after single dose. n = 20

表2　多次給藥后家兔陰道黏膜刺激性評(píng)分觀(guān)察結(jié)果. n = 20Tab 2　Vaginal irritation score results of rabbits after multiple doses. n = 20

3.3子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

圖1　各組病理切片圖A – 空白對(duì)照組，B – 空白基質(zhì)組，C – 低劑量組，D – 中劑量組，E – 高劑量組；1 – 陰道，2 – 子宮Fig 1　Pathological section photographs of each groupA – blank control group, B – blank matrix group, C – low dose group, D – middle dose group, E – high dose group; 1 – vagina, 2 – uterus

空白基質(zhì)組，陽(yáng)性對(duì)照組，低、中、高劑量組的Mcphail指數(shù)分別為（0.25±0.46）、（3.20±0.27）、（1.00±0.61）、（1.75±0.50）、（2.25±0.50）。結(jié)果表明，隨著黃體酮凝膠劑用量的增加，子宮分級(jí)指數(shù)呈增加趨勢(shì)，空白基質(zhì)組、低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間有顯著性差異（P ＜ 0.05），中、高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（P ＞ 0.05）。由子宮病理切片可知，與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組，低、中、高劑量組子宮內(nèi)膜有不同程度的增生，陽(yáng)性對(duì)照組更為明顯；低、中、高劑量組隨著給藥劑量的增加腺體開(kāi)始延長(zhǎng)；陽(yáng)性對(duì)照組腺體幾乎延伸到肌肉層，間質(zhì)極少，同時(shí)腺體增多（見(jiàn)圖3）。這說(shuō)明給予黃體酮凝膠劑后，隨著給藥劑量的增加，子宮內(nèi)膜厚度增加，幼兔的孕酮反應(yīng)增強(qiáng)，提示藥物有一定的作用。

圖2　各組多次給藥后病理切片圖A – 空白對(duì)照組，B – 空白基質(zhì)組，C – 低劑量組，D – 中劑量組，E – 高劑量組；1 – 陰道，2 – 子宮Fig 2　Pathological section photographs after multiple doses of each groupA – blank control group, B – blank matrix group, C – low dose group, D – middle dose group, E – high dose group; 1 – vagina, 2 – uterus

4　討論

4.1刺激性研究

圖3　子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)家兔子宮病理切片A – 空白對(duì)照組，B – 空白基質(zhì)組，C – 陽(yáng)性對(duì)照組，D – 低劑量組，E – 中劑量組，F(xiàn) – 高劑量組Fig 3　Uterus pathological section of rabbits in endometrial transformation experimentA – blank control group, B – blank matrix group, C – positive control group, D – low dose group, E – middle dose group, F – high dose group

為了探討本實(shí)驗(yàn)室制得的黃體酮凝膠劑的用藥安全性，本文對(duì)黃體酮凝膠劑陰道給藥的刺激性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明黃體酮凝膠劑單次給藥后，與空白對(duì)照組相比，各組基本未出現(xiàn)紅斑、水腫和分泌物，其中低劑量組家兔的紅斑和水腫情況反而高于中、高劑量組，其原因可能是家兔的個(gè)體差異，也可能是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中人為操作失誤。黃體酮凝膠劑經(jīng)過(guò)10 d多次給藥后，與空白對(duì)照組相比，各組家兔也均未出現(xiàn)明顯的紅斑、分泌物滲出，中、高劑量組可見(jiàn)輕微水腫。病理切片結(jié)果表明，單次或多次給藥后，與空白對(duì)照組相比，各組陰道上皮黏膜未見(jiàn)脫落，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，子宮病理切片未見(jiàn)明顯變化。結(jié)合刺激性評(píng)分結(jié)果說(shuō)明黃體酮凝膠劑單次或多次給藥后，對(duì)家兔陰道和子宮無(wú)明顯刺激性。

4.2子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

關(guān)于黃體酮凝膠劑的藥效考察，本文采用文獻(xiàn)[9]報(bào)道的子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)來(lái)考察其對(duì)子宮的影響，初步判斷其藥效。該方法簡(jiǎn)便、可靠，其方法為選用未成熟幼兔，給藥一段時(shí)間后，根據(jù)子宮分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（即Mcphail指數(shù)）判斷子宮的分級(jí)，從而考察藥物對(duì)子宮內(nèi)膜、子宮腺體的影響。本文結(jié)果表明，幼兔在給予黃體酮凝膠劑后，子宮分級(jí)指數(shù)隨劑量的增加而增大，呈現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，子宮病理切片也顯示子宮內(nèi)膜增厚，腺體增多，表明黃體酮凝膠劑與市售黃體酮注射液相比，同樣可以發(fā)揮孕酮樣作用。

綜上所述，黃體酮凝膠劑單次或多次給藥后，對(duì)家兔陰道和子宮無(wú)明顯刺激性，子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明黃體酮凝膠劑具有一定的孕激素活性，可使幼兔子宮內(nèi)膜發(fā)育，具有一定的孕酮樣作用，這為制備該劑型的可行性奠定了基礎(chǔ)，但其藥效作用仍有待進(jìn)一步深入研究。

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Irritation test and endometrial transformation experiment of progesterone gel on rabbits after vaginal delivery

WANG Mei1, HOU Yan-xia1, CHANG Zhan-ying1, HE Bing2, ZHOU Xue-feng1(1. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2. Xinjiang Uygur Autonomous Region People's Hospital, Urumqi 830000, China)

Objective:To study vaginal irritation and effect on the lining of the uterus after vaginal delivered progesterone gel, and investigate the practicability of progesterone gel preparation.Methods:A total of 20 female rabbits were randomly divided into fi ve groups: blank control group, blank matrix group, low dose group, middle dose group, and high dose group. Then the irritation of progesterone vaginal gel was studied after a single dose and multiple doses. The results were scored according to vaginal irritation grading standard tables and classi fi cation criteria for vaginal irritation after observation. Furthermore, initial pharmacodynamics of progesterone gel was studied. The vagina and uterus of every rabbit was detected as well as the results were measured by transforming activity of each rabbit.Results:Compared with the blank control group, after a single dose and multiple doses, the rabbits in each group showed no obvious erythema and exudate. Biopsy results showed that there was no significant difference between rabbits in each group. In the initial pharmacodynamical study, the Mcphail indexes in blank matrix group, low, middle, high dose group and positive control group were (0.25 ± 0.46), (1.00 ± 0.61), (1.75 ± 0.50), (2.25 ± 0.50), (3.20 ± 0.27) respectively after 23 d treatments. Uterine pathological results showed the uterus changes from the proliferative phase to the secretory phase were all observed in the low, middle and high dose group.Conclusion:No significant vaginal and uterus irritation was observed in rabbits after vaginal delivery of progesterone gel with single or multiple doses. Furthermore, progesterone gel has certain progesterone activity, which shows that this formulation is feasible.

Progesterone; Gel; Irritation; Endometrium

R94

A

1672 – 8157(2014)06 – 0351 – 05

2014-07-08

2014-10-15）

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃資助項(xiàng)目（XJEDU2011S25）

王梅，女，副教授，研究方向：藥物新劑型及靶向給藥制劑的研究。E-mail：wm630@163.com