硫酸鏈霉素分子印跡傳感器的研究

陳怡等

摘要：基于分子印跡技術(shù)，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過(guò)循環(huán)伏安電聚合在玻碳電極表面構(gòu)建出對(duì)STR具有選擇特異性的電化學(xué)傳感器，且制備過(guò)程中STR無(wú)需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關(guān)鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學(xué)傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和動(dòng)物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過(guò)誘導(dǎo)抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鏈霉素檢測(cè)的報(bào)道主要有基于微生物的檢測(cè)法[5]、免疫學(xué)檢測(cè)法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯(lián)免疫法和微生物法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團(tuán)，往往需要進(jìn)行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，而且大型設(shè)備的使用對(duì)操作人員要求較高，檢測(cè)成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機(jī)溶劑、酸堿等條件下穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[11]，已作為傳感器識(shí)別元件應(yīng)用于環(huán)保、生物分析、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，提供定量或半定量檢測(cè)分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡(jiǎn)便，膜厚可控，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻(xiàn)[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現(xiàn)性良好。本實(shí)驗(yàn)以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經(jīng)電化學(xué)聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需對(duì)鏈霉素進(jìn)行衍生處理，而是間接地通過(guò)電化學(xué)手段分析，操作簡(jiǎn)單快捷，特異性強(qiáng)，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動(dòng)化的電化學(xué)傳感器的研究提供依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學(xué)工作站（天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預(yù)處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區(qū)間內(nèi)， 以0.1 V/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描，待循環(huán)伏安響應(yīng)穩(wěn)定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預(yù)處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質(zhì)），通純N2 預(yù)聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區(qū)間內(nèi)采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經(jīng)70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進(jìn)行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實(shí)驗(yàn)中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會(huì)造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測(cè)到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印跡技術(shù)，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過(guò)循環(huán)伏安電聚合在玻碳電極表面構(gòu)建出對(duì)STR具有選擇特異性的電化學(xué)傳感器，且制備過(guò)程中STR無(wú)需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關(guān)鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學(xué)傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和動(dòng)物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過(guò)誘導(dǎo)抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鏈霉素檢測(cè)的報(bào)道主要有基于微生物的檢測(cè)法[5]、免疫學(xué)檢測(cè)法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯(lián)免疫法和微生物法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團(tuán)，往往需要進(jìn)行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，而且大型設(shè)備的使用對(duì)操作人員要求較高，檢測(cè)成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機(jī)溶劑、酸堿等條件下穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[11]，已作為傳感器識(shí)別元件應(yīng)用于環(huán)保、生物分析、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，提供定量或半定量檢測(cè)分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡(jiǎn)便，膜厚可控，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻(xiàn)[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現(xiàn)性良好。本實(shí)驗(yàn)以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經(jīng)電化學(xué)聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需對(duì)鏈霉素進(jìn)行衍生處理，而是間接地通過(guò)電化學(xué)手段分析，操作簡(jiǎn)單快捷，特異性強(qiáng)，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動(dòng)化的電化學(xué)傳感器的研究提供依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學(xué)工作站（天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預(yù)處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區(qū)間內(nèi)， 以0.1 V/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描，待循環(huán)伏安響應(yīng)穩(wěn)定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預(yù)處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質(zhì)），通純N2 預(yù)聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區(qū)間內(nèi)采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經(jīng)70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進(jìn)行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實(shí)驗(yàn)中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會(huì)造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測(cè)到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。

摘要：基于分子印跡技術(shù)，以硫酸鏈霉素（STR）為模板分子，鄰苯二胺（OPD）為功能單體，通過(guò)循環(huán)伏安電聚合在玻碳電極表面構(gòu)建出對(duì)STR具有選擇特異性的電化學(xué)傳感器，且制備過(guò)程中STR無(wú)需衍生處理。以K3[Fe（CN）6]為探針的方波伏安（SWV）分析，模板分子與單體的摩爾配比為1∶4、洗脫溶劑為70%乙醇溶液，在此條件下制備的傳感器性能良好。

關(guān)鍵詞：硫酸鏈霉素； 鄰苯二胺； 分子印跡； 電聚合； 電化學(xué)傳感器

1引言

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基糖苷類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著的抗菌活性，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑和動(dòng)物疾病治療中，臨床上一般使用其硫酸鹽。然而，鏈霉素具有腎毒性和耳毒性，能夠引起過(guò)敏反應(yīng)，濫用、不遵守休藥期、超量用藥造成的藥物殘留直接或通過(guò)誘導(dǎo)抗性菌株間接威脅人、畜的健康[1～4]。鏈霉素殘留物主要存在于肉類，肝，腎，牛奶以及蜂蜜中。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于鏈霉素檢測(cè)的報(bào)道主要有基于微生物的檢測(cè)法[5]、免疫學(xué)檢測(cè)法[6，7]和儀器分析法[1，8，9]。微生物法所需設(shè)備簡(jiǎn)單，但不易篩選到特異敏感菌株，易受條件限制，靈敏度低；酶聯(lián)免疫法和微生物法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，通常僅用于普通篩查；高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LCMS/MS）等方法靈敏高。但是，鏈霉素缺少紫外吸收生色基團(tuán)，往往需要進(jìn)行一系列柱前或者柱后衍生處理后再進(jìn)行檢測(cè)，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，而且大型設(shè)備的使用對(duì)操作人員要求較高，檢測(cè)成本高[10]。

分子印跡聚合物（MIPs）具有成本低，易于合成，在高溫、有機(jī)溶劑、酸堿等條件下穩(wěn)定性高的特點(diǎn)[11]，已作為傳感器識(shí)別元件應(yīng)用于環(huán)保、生物分析、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域，提供定量或半定量檢測(cè)分析 [12～14]。采用電聚合方法制備分子印跡聚合膜操作簡(jiǎn)便，膜厚可控，特異性強(qiáng)，重現(xiàn)性高，且可以水溶液中完成聚合[15]。文獻(xiàn)[16，17]采用此法制備的分子印跡聚合膜選擇性、靈敏度及重現(xiàn)性良好。本實(shí)驗(yàn)以硫酸鏈霉素為模板分子、鄰苯二胺為功能單體，經(jīng)電化學(xué)聚合制備了硫酸鏈霉素分子印跡電化學(xué)傳感器，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)需對(duì)鏈霉素進(jìn)行衍生處理，而是間接地通過(guò)電化學(xué)手段分析，操作簡(jiǎn)單快捷，特異性強(qiáng)，靈敏度較高，成本低，為小型化和自動(dòng)化的電化學(xué)傳感器的研究提供依據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

LK2005A 型電化學(xué)工作站（天津市蘭力科化學(xué)電子高技術(shù)有限公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE，Φ=4 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑片電極為對(duì)電極（天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

硫酸鏈霉素（Streptomycin sulfate，STR，純度>99%，上海生工生物有限公司）；鄰苯二胺（oPhenylenediamine，OPD，分析純，北京鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司）； K3[Fe（CN）6]（分析純，天津市永大化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；其余試劑均為分析純。

2.2玻碳電極預(yù)處理

將玻碳電極依次在涂有0.3 和0.05 μm Al2O3漿液的麂皮上拋光至鏡面，再用HNO3溶液（1∶1， V/V）、無(wú)水乙醇和二次蒸餾水分別超聲清洗3 min。將電極置于0.5 mol/L H2SO4溶液中，在-1.0～+0.8 V電位區(qū)間內(nèi)， 以0.1 V/s的掃速進(jìn)行循環(huán)伏安（CV）掃描，待循環(huán)伏安響應(yīng)穩(wěn)定，氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，電極預(yù)處理完成。

2.3分子印跡膜的制備

將處理好的電極浸入含有20 mmol/L鄰苯二胺、5 mmol/L硫酸鏈霉素和0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 5.0）的聚合底液（含0.1 mol/L KCl，作為支持電解質(zhì)），通純N2 預(yù)聚合10 min后，在0～0.8 V的電位區(qū)間內(nèi)采用CV掃描20圈，掃速為0.05 V/s。電極取出后，經(jīng)70%乙醇溶液洗脫后得到硫酸鏈霉素分子印跡聚合膜電極（MIP/GCE）。非印跡聚合膜電極（NIP/GCE）的制備以同樣的方法進(jìn)行，只是聚合物底液中不加入模板分子。

2.4印跡膜的洗脫

制備多支印跡及非印跡電極，分別浸入到1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L H2SO4溶液和70% 乙醇溶液中洗脫若干分鐘，取出后用二次蒸餾水淋洗5 min，以洗脫出模板分子，并在含有4 mmol/L K3[Fe（CN）6] 的PBS緩沖液中洗脫，采用方波伏安法（SWV）比較洗脫效果。實(shí)驗(yàn)中印跡膜電極制備的條件相同，但是由于裸玻碳電極每次打磨拋光情況不能確保一致，會(huì)造成制備的印跡膜存在輕微差異。為了減小誤差，洗脫效果用溶劑洗脫前后電極在K3[Fe（CN）6]溶液中檢測(cè)到的方波伏安峰電流變化值（Δip）表征。