合相色譜法鑒別香草提取物

Paula+Hong+Michael+Jones+Patricia+McConville

為降低香草提取的成本，一些制造商使用合成或人工香料替代更為昂貴的純香草。很多時(shí)候，這些便宜的替代品包含合成成分，例如乙基香草醛。但某些提取物含有潛在危害性摻雜物，其中包括香豆素，即零陵香豆散發(fā)出的香味。這種特殊的摻雜物是一種可疑致癌物，可以與血液稀釋藥物發(fā)生反應(yīng)。在美國(guó)，香豆素已被禁止用做食品成分，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局針對(duì)近年來(lái)其在香草提取物中的濫用發(fā)出了消費(fèi)者警告。

現(xiàn)在已開(kāi)發(fā)出大量的反相液相色譜（RPLC）方法用于分析，以確定香草提取物中的真實(shí)成分。這些方法能夠篩選出合成和人工香料，以及香草醛的次生成分，后者是香草豆莢正宗提取物的標(biāo)志物。這些方法可實(shí)現(xiàn)高通量分析，正交分離可依據(jù)不同的選擇性帶來(lái)便利。UPC2？技術(shù)針對(duì)香草醛的強(qiáng)極性、次生成分的保留性更強(qiáng)，能夠?qū)撛谖：π苑菢O性摻雜物進(jìn)行充分保留和鑒定。例如在反相分離中，某些香草醛次生化合物（例如香草酸）的保留性很差，使得這些極性成分的分離很困難。在合相色譜法中，各組分的洗脫性能相反，從而實(shí)現(xiàn)了強(qiáng)極化化合物更長(zhǎng)的保留時(shí)間以及更好的分離度。

解決方案

使用含有來(lái)自香草豆莢（香草醛，對(duì)羥基苯甲酸，對(duì)羥基苯甲醛和香草酸）的香味成分，以及合成香草醛（乙基香草醛）和禁用摻雜物香豆素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行方法開(kāi)發(fā)。標(biāo)準(zhǔn)溶液由異丙醇制備。實(shí)驗(yàn)采用ACQUITY UPC2TM BEH 2-EP 130？ 3.0x100mm，1.7μm色譜柱開(kāi)發(fā)出一個(gè)2.5min的方法，如圖1所示。UV方法條件中使用了20mm檸檬酸的甲醇溶液作為改性劑/添加劑，用以改善酸性成分的峰形。

實(shí)驗(yàn)針對(duì)UV方法的重復(fù)性（表1）和線性（表2）進(jìn)行了評(píng)估。配制0.250～500μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在12.5μg/mL濃度下，保留時(shí)間的重復(fù)性（n=5）≤0.10%RSD，相同標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣的峰面積重復(fù)性為<1.80%RSD。線性范圍涵蓋兩至三個(gè)數(shù)量級(jí)，與分析物相關(guān)，R2>0.999（表2）。被測(cè)分析物的定量限（LOQ）的范圍在0.250～1.25μg/mL之間。如果在分析香草提取物時(shí)需要稀釋樣品，使用UV法可滿足此特定分析的靈敏度要求。

為檢測(cè)摻雜物，將此方法用于篩選來(lái)自不同地理區(qū)域的香草提取物（包括標(biāo)記為“純品”和“仿制品”的樣品），見(jiàn)圖2。使用乙醇對(duì)香草提取物進(jìn)行10倍稀釋（樣品混溶），并在分析前過(guò)濾。來(lái)自美國(guó)的香草提取物仿制品（A）的分析結(jié)果顯示：同時(shí)存在合成香草醛（乙基香草醛）和香草醛。由于此樣品中不存在其他天然香料成分，說(shuō)明香草醛極有可能是合成的。在美國(guó)之外購(gòu)得的已知香草提取物的偽造品（B）含有摻雜的香豆素以及香草醛，由于不含次生香草成分，因此也很可能來(lái)源于合成。最后，標(biāo)記為“純品”的香草提取物（C）的分析結(jié)果確認(rèn)其為真品。此樣品中同時(shí)鑒定出了香草醛和次生天然香料成分，并進(jìn)行了定量分析。此外，香草醛和對(duì)羥基苯甲醛的比值為14.9，位于純正香草提取物之前的指示范圍內(nèi)（表3）。

總 結(jié)

Waters ACQUITY UPC2系統(tǒng)采用CO2流動(dòng)相配合有機(jī)共溶劑和添加劑，可為RPLC提供正交選擇性。對(duì)于香草提取物的分析，此項(xiàng)分離技術(shù)使香草醛的強(qiáng)極性、次生成分的保留性更強(qiáng)，并對(duì)非極性摻雜物進(jìn)行充分的保留和鑒定。此外，相比于傳統(tǒng)的RPLC法，此項(xiàng)色譜技術(shù)可提高效率、降低溶劑用量，同時(shí)是一種適用于分析香草提取物的高通量、靈敏的篩選方法。endprint