甲基綠褪色分光光度法測定紅霉素

陳蓮惠 葉 莉 謝 夢

(1川北醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，四川 南充 637000； 2川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000)

0 引言

紅霉素常用于對青霉素耐藥的革蘭陽性細(xì)菌感染及對青霉素過敏的患者，對肺炎、扁桃體炎等很多炎癥有很好的療效。已報道的紅霉素測定方法有高效液相色譜法[1]、微生物檢測法[2]、電荷轉(zhuǎn)移分光光度法[3]、電化學(xué)方法[4]、比濁法[5]等。這些方法都有優(yōu)缺點(diǎn)。紅霉素在中性條件下能與甲基綠反應(yīng)生成締合物，較甲基綠的吸光度有明顯降低，在635 nm附近測定其吸光度降低值，發(fā)現(xiàn)吸光度的降低值與紅霉素的濃度成正比，由此我們建立了測定紅霉素的褪色分光光度法。與其它測定紅霉素的方法相比，該法簡便可靠，重現(xiàn)性和選擇性較好。文中還探討了反應(yīng)和測定的最佳條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

721分光光度計(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫水槽-DKB-S420(臺灣斯特儀器設(shè)備有限公司)；PHS-3C酸度計(上海儀電科學(xué)儀器有限公司)；ML104電子天平(杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司)。

磷酸，冰乙酸，無水乙醇，硼酸，氫氧化鈉均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水皆為二次蒸餾水；紅霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品(Erythromycin，中國藥品生物制品檢定所)，甲基綠標(biāo)準(zhǔn)樣品(Methyl Green，成都科龍化工試劑廠)，紅霉素腸溶片(吉林省長恒藥業(yè)有限公司)，紅霉素腸溶片(輔仁藥業(yè)集團(tuán)公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

紅霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取紅霉素標(biāo)準(zhǔn)樣品100.2 mg，用無水乙醇配制成50.00 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，使用時用水稀釋為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

甲基綠溶液(3.29×10-4mol/L)：準(zhǔn)確稱取甲基綠標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g配制成500.00 mL水溶液，搖勻，使用時稀釋為1.64×10-4mol/L的工作溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作

準(zhǔn)確移取4.00 mL紅霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于15.00 mL比色管中，再加入甲基綠工作溶液4.00 mL，用水稀釋至刻度并搖勻，40 ℃恒溫水槽中水浴加熱20 min，冷卻至室溫，試劑空白作參比，在635 nm處測定吸光度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 檢測波長

按照實(shí)驗(yàn)方法反應(yīng)后，分別對紅霉素溶液、甲基綠溶液和甲基綠-紅霉素混合溶液進(jìn)行吸光度測定。結(jié)果如圖1顯示：在可見光區(qū)紅霉素溶液幾乎對光無吸收；甲基綠卻有強(qiáng)烈的吸收，且最大吸收波長在635 nm附近；甲基綠和紅霉素的混合溶液有吸收，但較甲基綠有明顯褪色，褪色最明顯時對應(yīng)的波長為635 nm，故選635 nm為測定波長。

圖1 吸收光譜(以水作參比)Figure 1 Absorption spectra (against water).

2.2 反應(yīng)條件選擇

2.2.1 稀釋劑

實(shí)驗(yàn)了水、甲醇、乙醇作溶劑定容時對顯色反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，無論用何種溶劑作稀釋劑對實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無明顯影響。本實(shí)驗(yàn)選用水作稀釋劑。

2.2.2 緩沖溶液

實(shí)驗(yàn)了HAc-NaAc，B.R.，Tris-HCl，H2PO4--HPO42-等幾種常見的緩沖溶液對實(shí)驗(yàn)體系吸光度的影響，結(jié)果顯示：有氫氧化鈉參與配制的緩沖溶液讓體系褪色更為明顯，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明是甲基綠在氫氧化鈉溶液中顯示無色，與紅霉素存在與否沒有任何關(guān)系；在弱酸性HAc-NaAc緩沖溶液中，體系顏色加深了，在測定范圍內(nèi)檢測到體系吸光度值均比不加緩沖溶液時要小，誤差變大。故本實(shí)驗(yàn)不加緩沖溶液。

2.2.3 顯色劑用量

按照實(shí)驗(yàn)方法，加入2.00，4.00，6.00，8.00 mL等不同用量的甲基綠工作溶液，測定吸光度，結(jié)果顯示：當(dāng)顯色劑用量為6.00 mL以上時，相對吸光度不再明顯增加。本實(shí)驗(yàn)選用4.00 mL。

2.2.4 反應(yīng)溫度

按照實(shí)驗(yàn)方法，將配制好的相同濃度的11個混合溶液分別置于0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100 ℃等不同溫度的水浴中恒溫20 min，冷卻(或升溫)到室溫，用試劑空白作參比分別測定各溶液吸光度。結(jié)果表明，40 ℃下的反應(yīng)液吸光度差值最大，故選擇40 ℃為體系的反應(yīng)溫度。

2.2.5 顯色時間

按照實(shí)驗(yàn)方法，將最佳反應(yīng)條件下的體系加熱反應(yīng)20 min后冷卻至室溫，放置5，10，15，20，25，30，40，50 min；1，1.5，2，3 h后進(jìn)行測定。結(jié)果顯示：各個時間點(diǎn)測得的吸光度基本一致，即使將體系放置6 h后再測定，吸光度變化值也不超過±5%，可見體系穩(wěn)定性好。

2.2.6 干擾實(shí)驗(yàn)

在最佳測試條件下，考察了常見維生素、無機(jī)鹽離子、8種氨基酸、糖類等共存物質(zhì)對體系吸光度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：Bi3+，Re3+，四環(huán)素和強(qiáng)力霉素等有一定干擾，而較大倍數(shù)的Na+，Cl-，K+，I-，H2PO4-，HCO3-等大多數(shù)無機(jī)離子和一定量的氨基酸、糖類均不干擾。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(表2)也顯示藥物中的輔料對測定幾乎無影響。

表1 共存物質(zhì)的影響(紅霉素腸溶片溶液：0.067 mg/mL) Table 1 Interferences of the coexisting substances(CErythromycin is 0.067 mg/mL)

2.3 工作曲線和參數(shù)

用移液管移取一系列不同體積的紅霉素工作液于一系列15.00 mL比色管中，按實(shí)驗(yàn)方法加入甲基綠溶液，在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)完全，測定吸光度差值，將吸光度差值縱坐標(biāo)、紅霉素濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線。結(jié)果表明：紅霉素的濃度在0.000 6～0.105 0 mg/mL范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，服從Beer定律，線性回歸方程為：A=-7.41c+0.025 9，r=0.999 2；對15.00 mL 5.0×10-3mg/mL紅霉素測定6次，RSD=0.8%。方法的檢出限為0.26 μg/mL。表觀摩爾吸光系數(shù)ε為4.23×104L/(mol·cm)-1。

2.4 樣品測定

取兩個不同廠家的紅霉素腸溶片各4片，按照2010版藥典，在研缽中研細(xì)，用無水乙醇50 mL分次研磨使紅霉素腸溶片溶解，定量轉(zhuǎn)移到500.00 mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容，搖勻，靜置。實(shí)驗(yàn)時精密量取上清液適量在最佳實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行測定。同時往樣品中加入已知量的紅霉素標(biāo)準(zhǔn)品(加入量為4.00 μg/mL)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。由此可知：用所建立的褪色光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，測定值與正規(guī)廠家生產(chǎn)及標(biāo)示的含量基本一致；加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)顯示該法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較理想。

表2 樣品測定與加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Table 2 Analytical results of samples and recovery tests (n=6)

3 結(jié)語

通過甲基綠和紅霉素反應(yīng)前后吸收光譜研究和條件實(shí)驗(yàn)，我們建立了一種測定紅霉素的褪色分光光度法。用所建立的褪色光度法測定紅霉素腸溶片中的紅霉素，測定值與正規(guī)廠家生產(chǎn)及標(biāo)示的含量基本一致；方法簡便快捷、檢測限低，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)顯示該法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性較理想，可用來測定紅霉素腸溶片中的紅霉素含量。

[1] 于慧娟,蔡友瓊,顧潤潤.高效液相色譜法測定紅霉素、甲紅霉素和羅紅霉素的研究[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2006,25(6)：63-66.

[2] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].2010版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010,301.

[3] 李春香,徐婉珍,閆永勝.結(jié)晶紫-紅霉素體系電荷轉(zhuǎn)移分光光度法測定紅霉素的研究[J].藥物分析雜志,2006,26(12)：1737-1739.

[4] Helena T,Britt-maric E.Determination of erythromycin in gastric-juice and blood plasma by liquid chromatography and electrochemical detection[J]. J Chromatogr B, 1995,673：81.

[5] 劉珂.比濁法自動測定紅霉素及紅霉素腸溶片的效價[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2010,11(3)：204-206.