分泌吲哚乙酸的蔞蒿內(nèi)生耐鎘細(xì)菌的篩選與鑒定

周小梅，趙運(yùn)林，胥正鋼，董萌，庫(kù)文珍

分泌吲哚乙酸的蔞蒿內(nèi)生耐鎘細(xì)菌的篩選與鑒定

周小梅1，趙運(yùn)林2*，胥正鋼3，董萌1，庫(kù)文珍1

1. 湖南城市學(xué)院建筑與城市規(guī)劃學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413000；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128

從蔞蒿（Artemisia selengensis）體中分離分泌吲哚乙酸（IAA）的內(nèi)生耐鎘（Cd）細(xì)菌將有助于構(gòu)建有效的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系。本研究以分泌IAA和Cd耐性為篩選指標(biāo)，采用研磨法從蔞蒿的根、莖、葉中分離能產(chǎn)生IAA的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌，并對(duì)其鉛（Pb）、銅（Cu）、銻（Sb）的耐受性及對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)特性的影響進(jìn)行研究，根據(jù)形態(tài)特性、生理生化測(cè)定和16S rDNA序列分析對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定。結(jié)果表明，從蔞蒿體內(nèi)分離獲得2株分泌IAA能力較強(qiáng)的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌J2和Y5，J2和Y5菌對(duì)Cd的耐受質(zhì)量濃度均為90 mg·L-1，IAA的分泌量分別為23.108、15.192 mg·L-1；J2菌能明顯增加蔞蒿的株高、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、平均根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量，Y5菌可顯著提高蔞蒿的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量；J2和Y5菌對(duì)Pb的耐受質(zhì)量濃度均為1200 mg·L-1，對(duì)Cu的耐受質(zhì)量濃度分別為120和160 mg·L-1，對(duì)Sb的耐受質(zhì)量濃度分別為50和150 mg·L-1；J2菌在LB平板上菌落為黃色、近圓形、粘稠，Y5菌在LB平板上菌落為白色、近圓形、濕潤(rùn)；J2和Y5菌的16S rDNA序列經(jīng)擴(kuò)增，分別獲得1條大小約為1500 bp的條帶，經(jīng)比對(duì)分別與GenBank中Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）、Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似性最高，結(jié)合形態(tài)特征與生理生化特性可分別鑒定為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。研究表明，從蔞蒿體中分離獲得分泌IAA能力較強(qiáng)的內(nèi)生耐Cd成團(tuán)泛菌和熒光假單胞菌，為進(jìn)一步研究其在蔞蒿修復(fù)Cd污染土壤中的作用奠定了基礎(chǔ)。

蔞蒿；吲哚乙酸；內(nèi)生耐鎘細(xì)菌；篩選；鑒定

洞庭湖是我國(guó)第二大淡水湖泊，位于湖南省東北部，由于礦產(chǎn)資源的不合理開(kāi)采及廢物排放等因素導(dǎo)致其濕地土壤中重金屬鎘（Cd）污染嚴(yán)重（董萌等，2013a；Wang等，2008）。Cd為“五毒（Cd、汞（Hg）、鉛（Pb）、鉻（Cr）、砷（As））之首”，在土壤中長(zhǎng)期積累不僅影響土壤的生態(tài)功能，而且還可通過(guò)食物鏈最終危害人類(lèi)的身體健康（Chaney等，2004；崔巖山和陳曉晨，2010）。由于洞庭湖濕地面積遼闊，地形復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的物理、化學(xué)修復(fù)方法很難達(dá)到預(yù)期的修復(fù)效果，因此建立有效的植物-微生物聯(lián)合修復(fù)體系具廣闊的應(yīng)用前景，該研究的重點(diǎn)是尋找富集植物及與其匹配的功能微生物。

蔞蒿（Aremisia selengensis）是菊科蒿屬多年生草本植物，在洞庭湖濕地土壤中廣泛分布，是洞庭湖濕地土壤的一種優(yōu)勢(shì)植物，對(duì)Cd具較強(qiáng)富集能力，是洞庭湖濕地Cd污染土壤的理想修復(fù)材料（董萌等，2011）。在Cd污染條件下蔞蒿的修復(fù)特性，防御機(jī)制和解毒機(jī)制已不乏研究（董萌等，2013b；董萌等，2013c），但由于蔞蒿生物量小等原因，限制了其在Cd污染土壤修復(fù)方面的應(yīng)用。

研究表明，具重金屬耐性的內(nèi)生細(xì)菌可通過(guò)固氮作用（Lian等，2009；楊成德等，2014），分泌1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶（周佳宇等，2013；黃蓋等，2013）、產(chǎn)生鐵載體（高曉星等，2013；于婷等，2014）、分泌吲哚乙酸（IAA）（Zhang等，2010）和溶磷（Ma等，2009）等途徑來(lái)改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，進(jìn)而提高植物的修復(fù)效果，而蔞蒿內(nèi)生細(xì)菌的篩選及其對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)與修復(fù)功能的

影響研究卻未見(jiàn)任何報(bào)道。

因此，本研究以分泌IAA及Cd耐性為指標(biāo)篩選蔞蒿的內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)菌株的Pb、銅（Cu）、銻（Sb）耐受性及對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)特性的影響等進(jìn)行研究，從形態(tài)特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析等方面對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行分類(lèi)鑒定，以期為進(jìn)一步揭示內(nèi)生細(xì)菌在蔞蒿修復(fù)Cd污染土壤中的作用奠定基礎(chǔ)，也為構(gòu)建高效的蔞蒿-微生物聯(lián)合修復(fù)體系打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1植物材料

蔞蒿于2012年5月采自南洞庭湖管竹山（112°19′33.4″E，28°55′14.9″N），裝袋密封帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（李振高等，2008）參照文獻(xiàn)配制；有氮培養(yǎng)基（劉琳等，2010）用于分泌IAA菌株的篩選和IAA的定量測(cè)定。

1.3內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

分別稱(chēng)取蔞蒿植株的根、莖、葉各1 g，自來(lái)水沖洗干凈，依次使用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡60 s，2.5%的次氯酸鈉溶液表面消毒10 min，無(wú)菌水清洗4次。無(wú)菌條件下，將根、莖、葉放入無(wú)菌研缽中，加入適量無(wú)菌水和無(wú)菌石英砂，充分研磨，定容至10 mL。稀釋成梯度稀釋樣品，分別從10-3、10-4、10-5稀釋液中取100 μL涂布于Cd離子質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出菌落后挑取單菌落劃線純化。同時(shí)，將表面消毒的最后一次洗滌水涂布于LB平板上以檢測(cè)植株樣品表面消毒是否徹底。

1.4分泌IAA的內(nèi)生耐鎘細(xì)菌的篩選

以Cd離子質(zhì)量濃度為0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，接種后，28 ℃倒置培養(yǎng)3 d，觀察Cd離子完全抑制菌株生長(zhǎng)的最低濃度即最小抑制濃度（MIC），作為菌株對(duì)Cd耐受性的判斷依據(jù)（潘風(fēng)山等，2014）。分泌IAA菌株的篩選方法參照劉琳等（2010），將耐Cd菌株接種于有氮培養(yǎng)基中（每管4 mL，加入過(guò)濾除菌的L-色氨酸（質(zhì)量濃度為2.5 mg·mL-1）1 mL），28 ℃，180 r·min-1搖床培養(yǎng)4 d，取菌液1 mL于滅菌的試管中，加入2 mL Sacowski顯色液（250 mL去離子水+150 mL濃硫酸+7.5 mL物質(zhì)量濃度為0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O）充分混合，室溫下避光顯色20 min，出現(xiàn)粉紅色，說(shuō)明有IAA產(chǎn)生。

1.5菌株分泌IAA的定量檢測(cè)

培養(yǎng)條件同上，分泌IAA的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)后10000 r·min-1離心10 min，取上清液加入等體積的Sacowski顯色液（250 mL去離子水+150 mL濃硫酸+7.5 mL物質(zhì)量濃度為0.5 mol·L-1的FeCl3·6H2O），室溫下避光顯色20 min，測(cè)定其OD530值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA的量。

1.6菌株對(duì)Pb、Cu、Sb的耐受性測(cè)定

分泌IAA的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌分別接種于含Pb離子質(zhì)量濃度為0、400、600、800、1000、1200、1500、2000 mg·L-1，Cu離子質(zhì)量濃度為0、40、80、120、160、200 mg·L-1，Sb離子質(zhì)量濃度為0、50、100、150、200 mg·L-1的LB固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察Pb、Cu、Sb離子的MIC值以判斷菌株的重金屬耐受性（潘風(fēng)山等，2014）。

1.7菌株對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)特性的影響

選取長(zhǎng)勢(shì)一致且?guī)в?個(gè)芽的蔞蒿莖段若干，置于已過(guò)夜培養(yǎng)的菌懸液中30 min（對(duì)照置于無(wú)菌水中）后扦插于已滅菌處理且添加Cd離子質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30 mg·kg-1的土樣中，每處理扦插16株。常規(guī)養(yǎng)護(hù)60 d后統(tǒng)計(jì)蔞蒿植株的株高、鮮重、干重、最長(zhǎng)根長(zhǎng)和平均根長(zhǎng)等指標(biāo)。

1.8菌株的分類(lèi)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：分泌IAA的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌于LB平板上培養(yǎng)3 d，觀察菌落的形態(tài)、光澤、質(zhì)地、邊緣特征、表面特征、隆起形狀、透明度及菌落顏色等特征。

生理生化測(cè)定：甲基紅（M.R.）、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、吲哚和V.P.等試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）進(jìn)行。

16S rDNA序列測(cè)定與分析：提取細(xì)菌DNA，選擇通用引物FD1（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’），RP2（5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’）（廖麗，2012）。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq Master Mix 25 μl，Primer FD1（10 μM）1.25 μL，Primer RP2（10 μM）1.25 μL，Template DNA 1.0 μL，H2O 21.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min；50 ℃退火1 min；72 ℃延長(zhǎng)1.5 min；30次循環(huán)，72 ℃下延伸10 min后，取2 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳，電泳條件為：5 v·cm-1，電泳緩沖液為T(mén)AE。PCR產(chǎn)物純化及測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司廣州分公司完成。通過(guò)BLAST軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行相似性分析，MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，首先用ClustalX1.81進(jìn)行多序列匹配，Kimura 2-parameter計(jì)算進(jìn)化距離，Neighbor-joining構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap分析進(jìn)化樹(shù)分枝的穩(wěn)定性，重復(fù)1000次。

2 結(jié)果與分析

2.1分泌IAA內(nèi)生耐鎘細(xì)菌的篩選

經(jīng)分離純化，從蔞蒿根、莖、葉中分離獲得耐質(zhì)量濃度為1 mg·L-1Cd離子的菌株共24株，采用不同Cd質(zhì)量濃度梯度的LB培養(yǎng)基進(jìn)行耐受性試驗(yàn)，篩選出6株Cd耐受能力較強(qiáng)的菌株，分別編號(hào)為T(mén)4、T7、T10、G5、J2、Y5，對(duì)Cd的耐受質(zhì)量濃度均達(dá)到90 mg·L-1。從IAA的顯色反應(yīng)來(lái)看，6株菌株均能不同程度地分泌IAA，經(jīng)定量測(cè)定，J2與Y5分泌IAA的能力較強(qiáng)（圖1），可作為目標(biāo)菌種進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 菌株T4、T7、T10、G5、J2和Y5分泌IAA量的測(cè)定Fig. 1 Determination quantity of IAA-producing of strains T4, T7, T10, G5, J2and Y5

2.2菌株J2和Y5對(duì)重金屬的耐受性

通過(guò)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)菌株J2和Y5對(duì)Pb離子的耐受性相似，對(duì)Cu離子和Sb離子的耐受性均以Y5較強(qiáng)，其中對(duì)Sb離子的耐受濃度表現(xiàn)為Y5是J2的3倍（表1）。

表1 菌株J2和Y5對(duì)重金屬離子的耐受質(zhì)量濃度Table 1 The tolerance mass concentration of heavy metal ions of strains J2 and Y5 mg·L-1

2.3菌株J2和Y5對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)特性的影響

從表2可知，菌株J2和Y5侵染蔞蒿植株后，對(duì)蔞蒿的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的影響，菌株J2可明顯增加蔞蒿的株高、最長(zhǎng)根長(zhǎng)、平均根長(zhǎng)、鮮重和干重，菌株Y5對(duì)蔞蒿的株高、鮮重和干重產(chǎn)生顯著影響。

表2 菌株J2和Y5對(duì)蔞蒿生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of strains J2and Y5on growth of Aremisia selengensis

2.4菌株J2和Y5的分類(lèi)鑒定

菌株J2在LB平板上菌落為黃色，近圓形，邊緣整齊完整，表面濕潤(rùn)，粘稠，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密。菌株Y5在LB平板上菌落為白色，近圓形，邊緣整齊完整，表面濕潤(rùn)透明，微隆起，與培養(yǎng)基結(jié)合緊密（圖2）。

圖2 菌株J2和Y5的菌落形態(tài)Fig. 2 Colony morphology of strains J2and Y5

M.R.、淀粉水解、檸檬酸鹽利用等是細(xì)菌鑒定常用指標(biāo)，J2、Y5菌生理生化特性的測(cè)定結(jié)果如表3，結(jié)合《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）可知，J2、Y5菌生理生化指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果與成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）相一致。

表3 菌株J2和Y5的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains J2 and Y5

16S rDNA基因序列可作為細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定最合適的指標(biāo)（崔瑩等，2014），本研究利用PCR方法對(duì)J2和Y5的16S rDNA進(jìn)行了擴(kuò)增，分別獲得1條大小約為1500 bp的條帶。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化測(cè)序后（GenBank accession numbers：KJ882378、KJ882377），與GenBank 中相似度較高的菌株進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株J2的16S rDNA序列與Pantoea agglomerans STY29（HQ220151）的相似度最高，Y5的16S rDNA序列與Pseudomonas fluorescens V7c10（KC195905）的相似度最高（表4，圖3）。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特性，J2與Y5菌可分別鑒定為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。

表4 菌株J2和Y5的16S rDNA序列相似性分析Table 4 Similarity analysis of 16S rDNA partial sequences of strains J2and Y5

3 討論

內(nèi)生細(xì)菌與植物的關(guān)系非常密切（馬瑩等，2013；劉莉華等，2013；姚領(lǐng)愛(ài)等，2010），兩者聯(lián)合作用可明顯提高植物對(duì)重金屬污染土壤的修復(fù)效果（Luo等，2012），其作用機(jī)制之一就是通過(guò)內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA來(lái)改善植物的營(yíng)養(yǎng)狀況，進(jìn)而提高其修復(fù)效果（Maity等，2013）。劉佳等（2011）研究表明，分泌IAA的內(nèi)生成團(tuán)泛菌HAUM1能明顯提高宿主水稻的生物量、葉綠素及磷含量。何琳燕等（2011）研究認(rèn)為，在Cd污染條件下分泌IAA的龍葵內(nèi)生細(xì)菌AR1、AY1能夠明顯促進(jìn)油菜幼苗根的伸長(zhǎng)。潘風(fēng)山等（2014）研究顯示，接種可產(chǎn)生IAA的內(nèi)生細(xì)菌SaN1顯著促進(jìn)油菜植株的生長(zhǎng)，提高植物對(duì)Cd的積累量。本研究以分泌IAA和Cd耐性為指標(biāo)，從蔞蒿體內(nèi)分離獲得2株產(chǎn)生IAA能力較強(qiáng)的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌J2和Y5，J2和Y5菌能顯著增加蔞蒿的生物量，表明J2和Y5菌能有效增加蔞蒿對(duì)Cd的實(shí)際積累量。

在重金屬脅迫條件下，內(nèi)生細(xì)菌往往可以同時(shí)耐受多種重金屬污染，利用內(nèi)生細(xì)菌的技術(shù)有望降低復(fù)合重金屬污染對(duì)植物的毒性，提高植物對(duì)重金屬的抗性（朱雪竹等，2010）。Abou-shanab等（2007）發(fā)現(xiàn)了多株可以同時(shí)耐受9種重金屬毒性的內(nèi)生細(xì)菌。Wei等（2009）從野生豆類(lèi)根部分離到的土壤桿菌可以同時(shí)耐受Cd、Cu、鋅（Zn）、Pb的毒性，并可促進(jìn)植物生長(zhǎng)。Idris等（2006）研究顯示，從超積累植物體內(nèi)篩選到的多株甲基營(yíng)養(yǎng)菌能夠耐受Cd、Zn、Cr、鎳（Ni）、鈷（Co）等多種重金屬毒性。在本研究條件下，獲得的內(nèi)生細(xì)菌J2和Y5除對(duì)Cd具一定耐受性外，對(duì)Pb、Cu、Sb也具一定的耐受能力。南洞庭湖濕地土壤中Cd、Pb、Cu、Sb尤其是Cd、Cu、Sb含量遠(yuǎn)超過(guò)湖南省和中國(guó)的表土背景值（董萌等，2010）。因此，在南洞庭湖濕地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的復(fù)合污染修復(fù)中菌株J2和Y5有望發(fā)揮其修復(fù)潛能。

目前已報(bào)道的能分泌IAA的內(nèi)生細(xì)菌主要包括芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、泛菌屬（Pantoea sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、伯克氏菌屬（Burkholderia sp.）、土壤桿菌屬（Agrobacterium sp.）等（黃蓋等，2013；劉琳等，2010；潘風(fēng)山等，2014；劉佳等，2011；何琳燕等，2011）。本研究獲得2株分泌IAA能力較強(qiáng)的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌J2、Y5，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)定、16S rDNA序列測(cè)定與相似性分析可鑒定為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。這一方面說(shuō)明了蔞蒿內(nèi)生細(xì)菌具一定的種屬多樣性，同時(shí)也說(shuō)明了泛菌屬和假單胞菌屬細(xì)菌分布廣泛。進(jìn)一步深入研究J2和Y5菌株對(duì)蔞蒿吸收、富集、轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒Cd能力的影響，將為構(gòu)建蔞蒿-微生物聯(lián)合修復(fù)洞庭湖濕地Cd污染土壤的體系提供理論依據(jù)。

圖3 菌株J2和Y5基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of strains J2and Y5based on 16S rDNA gene sequences

4 結(jié)論

以IAA的分泌能力和Cd耐受性為指標(biāo)，從對(duì)Cd具較高富集能力的洞庭湖濕地植物蔞蒿體內(nèi)分

離獲得2株產(chǎn)生IAA能力較強(qiáng)的內(nèi)生耐Cd細(xì)菌J2和Y5，J2、Y5菌對(duì)Cd的耐受質(zhì)量濃度均達(dá)到90 mg·L-1，IAA的分泌量分別為23.108、15.192 mg·L-1，能顯著促進(jìn)蔞蒿的生長(zhǎng)。經(jīng)形態(tài)特性、生理生化測(cè)定和16S rDNA序列分析可分別鑒定為成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）。J2和Y5對(duì)Pb、Cu、Sb也具一定的耐受性，在南洞庭湖濕地土壤Cd、Pb、Cu、Sb的復(fù)合污染修復(fù)中有望發(fā)揮其修復(fù)潛能。成團(tuán)泛菌和熒光假單胞菌分布較為廣泛，進(jìn)一步深入研究J2和Y5菌對(duì)蔞蒿修復(fù)Cd污染土壤的影響，為構(gòu)建蔞蒿-微生物聯(lián)合修復(fù)體系打下理論基礎(chǔ)。

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Screening and Identification of Indole Acetic Acid-Producing Cadmium-Resistant Endophytic Bacteria from Artemisia Selengensis

ZHOU Xiaomei1, ZHAO Yunlin2*, XU Zhenggang3, DONG Meng1, KU Wenzhen1
1. College of Architecture and Urban Planning, Hunan City University, Yiyang 413000, China; 2. Central South University of Forestry Science and Technology, Changsha 410004, China; 3. College of Bio-safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

To isolate indole acetic acid (IAA)-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from Artemisia selengensis is to help build an effective combined remediation system of plant and microorganism. Using IAA-producing and cadmium-tolerance as the screening indexes, isolated IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria from the root, stem and leaf of Artemisia selengensis by the grinding method, and determinated the tolerance of lead, copper, antimony and the effect of the strains on growth of Aremisia selengensis. Strains were identified based on morphological, physiological and biochemical properties as well as 16S rDNA sequence analysis. The results showed that, two cadmium-resistant endophytic bacteria which both have strong abilities to secrete IAA, named as J2and Y5,were isolated from Artemisia selengensis. The cadmium tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 90 mg·L-1. The IAA production of strains J2and Y5respectively were 23.108 mg·L-1, 15.192 mg·L-1. Strain J2could significantly increase the plant height, the longest root length, the average root length, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis; strain Y5could significantly improve the plant height, the fresh weight and the dry weight of Artemisia selengensis. The lead tolerance mass concentration of strains J2and Y5were up to 1200 mg·L-1, while the copper tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 120 mg·L-1and 160 mg·L-1, the antimony tolerance mass concentration of strains J2and Y5respectively were 50 mg·L-1and 150 mg·L-1. The colony of strain J2was yellow, suborbicular and sticky on LB tablet. The colony of strain Y5was white, suborbicular and moist on LB tablet. Strains J2and Y5respectively obtained one about 1500 bp band by amplifying 16S rDNA sequences, and by comparing strains J2and Y5showed the closest similarity of 16S rDNA sequences to Pantoea agglomerans STY29(HQ220151) and Pseudomonas fluorescens V7c10(KC195905) respectively in GenBank and thus were identified as Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens respectively in combination with morphological, physiological and biochemical properties. This research on IAA-producing cadmium-resistant endophytic bacteria of Pantoea agglomerans and Pseudomonas fluorescens isolated from Artemisia selengensis provided a theoretical framework for studying their roles in remedying cadmium contaminated soil of Artemisia selengensis.

Artemisia selengensis; indole acetic acid; cadmium-resistant endophytic bacteria; screening; identification

X172

A

1674-5906（2014）12-1980-06

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研基金項(xiàng)目（201304310）；湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2015JJ4012）；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010SK2004）；湖南省教育廳項(xiàng)目（13C118）

周小梅（1977年生），女，副教授，博士，主要研究方向?yàn)榄h(huán)境污染生態(tài)修復(fù)。E-mail:864759100@QQ.com

*通信作者：趙運(yùn)林，男，E-mail:zyl8291290@163.com

2014-08-17

周小梅，趙運(yùn)林，胥正鋼，董萌，庫(kù)文珍. 分泌吲哚乙酸的蔞蒿內(nèi)生耐鎘細(xì)菌的篩選與鑒定[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2014, 23(12): 1980-1985.

ZHOU Xiaomei, ZHAO Yunlin, XU Zhenggang DONG Meng, KU Wenzhen. Screening and Identification of Indole Acetic Acid-Producing Cadmium-Resistant Endophytic Bacteria from Artemisia Selengensis [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2014, 23(12): 1980-1985.