抗核抗體及抗核抗體譜的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法及結(jié)果分析

朱鳳丹 尹秀杉

四川省南充市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 637000

自身免疫性疾?。ˋutoimmune diseases，AID）是由機(jī)體免疫功能異常引起的，這類(lèi)疾病患者體內(nèi)常伴有如抑制性T細(xì)胞功能低下、體液免疫功能亢進(jìn)等免疫功能的異常，同時(shí)還可出現(xiàn)最具診斷與鑒別意義的自身抗體。筆者采用間接免疫熒光法（Indirect immunofluorescence，IIF）和免疫印跡法（Immumoblot test，IBT）檢 測(cè) 與AID相 關(guān) 的 自 身 抗體——抗核抗體（Antinuclear antibodies，ANA）、抗核抗體譜（Antinuclear antibodies spectrum，ANAs），并對(duì)近期檢測(cè)的2 317例樣本的結(jié)果資料進(jìn)行回顧性分析，旨在探討分析兩種方法聯(lián)合檢測(cè)在診斷AID的價(jià)值，為臨床減少漏診，提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集我院2013年1月－2014年6月間門(mén)診、住院、健康體檢等人群的自身免疫性疾病篩查或診斷資料2 317例，其中男845例，女1 472例，年齡0～93歲。按年齡分為0～12歲、13～18歲、19～35歲、36～55歲、≥56歲組。

1.2 IIF檢測(cè) ANA，以Hep－2細(xì)胞和猴肝切片作為抗原基質(zhì)，血清采用1∶100，1∶320，1∶1 000滴度系列，起始滴度為1∶100；檢測(cè)抗雙鏈DNA抗體（anti－double strand DNA antibody，dsDNA），以綠蠅短毛蟲(chóng)天然DNA作為抗原基質(zhì)，血清采用1∶10，1∶20，1∶40滴度系列，起始滴度為1∶10。商品試劑由德國(guó)歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司生產(chǎn)。

1.3 IBT檢測(cè) ANAs，包括抗nRP／Sm、抗Sm、抗SSA、抗Ro52、抗SSB、抗Scl－70、抗PM－Scl、抗Jo－1、抗CNEP B、抗PCAN、抗核小體、抗組蛋白、抗核糖體P蛋白、抗AMA M2、抗dsDNA抗體共15項(xiàng)（德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司）。血清標(biāo)本作1∶100稀釋。全自動(dòng)免疫印跡儀（奧地利Tecan公司），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后膜條用Lide 100掃描儀（日本佳能公司）掃描，EUROLineScan自動(dòng)判別軟件（德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷股份公司）自動(dòng)判讀，再進(jìn)行人工核對(duì)。

1.4 分組 2 317例受檢血清均同時(shí)檢測(cè)ANA和ANAs。為探討IIF和IBT對(duì)結(jié)締組織疾病的診斷效能，分為IIF組：僅用IIF檢測(cè)ANA；IBT組：僅用IBT檢測(cè)ANAs（IBT檢測(cè)ANAs，只要出現(xiàn)1條陽(yáng)性反應(yīng)帶，即定為陽(yáng)性）；IIF＋I(xiàn)BT組：同時(shí)用IIF和IBT檢測(cè)ANA和ANAs。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，兩組間率比較用χ2檢驗(yàn)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 317例受檢者中，ANA（＋）和／或ANAs（＋）共914例，其中女710例，男204例；36歲及以上年齡段，女458例，男147例。女性患自身免疫性疾病的可能性或發(fā)病率明顯高于男性，隨著年齡的增長(zhǎng)，男性和女性患病概率均呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同性別、不同年齡段ANA和／或ANAs陽(yáng)性例數(shù)〔n（%）〕

2.2 2 317例血清ANA和ANAs檢測(cè)結(jié)果中，ANA陽(yáng)性740例（31.9%），ANAs陽(yáng)性723例（31.2%），ANA和ANAs均陽(yáng)性549例，ANA（＋）和ANAs（＋）符合率74.2%，ANA（－）和ANAs（－）符合率89.0%，總體符合率84.2%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 2 317例樣本ANA和ANAs檢測(cè)結(jié)果〔n（%）〕

2.3 740例ANA陽(yáng)性結(jié)果，以顆粒型為主（占56.08%），其次為均質(zhì)性、胞漿顆粒型。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 740例ANA主要熒光核型

2.4 ANA（＋）／ANAs（＋）標(biāo)本不同核型中各特異性抗體分析。顆粒型多為SSA，Ro52，nRP／Sm抗體，均質(zhì)型多為SSA，Ro52和抗核小體抗體，胞漿顆粒型中多為SSA，Ro52和AMA－M2抗體，著絲點(diǎn)型多為CNEP B抗體。Ro52抗體是ANA譜中最活躍的抗體，幾乎可以見(jiàn)于各種核型，特異性較差。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 549例ANA（＋）／ANAs（＋）標(biāo)本不同核型中各特異性抗體的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本文對(duì)2 317例自身免疫性疾病相關(guān)抗體檢測(cè)的結(jié)果資料進(jìn)行了回顧性分析，筆者發(fā)現(xiàn)ANA和／或ANAs陽(yáng)性人群中，女性占77.7%，男性占22.3%，男女比為1∶3.48，表明女性患自身免疫性疾病的可能性或發(fā)病率高于男性。由于男女性別之間的免疫環(huán)境和免疫強(qiáng)度存在差異，女性較男性有更強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，即有更好的免疫反應(yīng)能力；同時(shí)由于雌激素的作用使女性下丘腦－垂體－腎上腺軸（HPA）對(duì)應(yīng)激的敏感性高于男性，HPA分泌的糖皮質(zhì)激素不僅是機(jī)體應(yīng)激應(yīng)答必要的內(nèi)分泌激素，而且還有抗炎和免疫抑制作用［1］，因此女性患自身免疫性疾病的概率明顯高于男性。從年齡段觀察，36～55歲的女性陽(yáng)性率達(dá)34.2%，明顯高于其他年齡段，36歲及以上年齡段陽(yáng)性率50.1%；而在男性人群，36歲及以上年齡段陽(yáng)性率16.1%，相對(duì)于其他年齡段較高。由此可見(jiàn)，36歲以上人群，無(wú)論男女性別，自身免疫性疾病發(fā)生的可能性或發(fā)病明顯增高。

本文對(duì)2 317例受檢者血清同時(shí)檢測(cè)ANA和ANAs。按準(zhǔn)斷效能分組判斷，IIF檢測(cè)ANA，陽(yáng)性740例，占檢測(cè)總數(shù)的31.9%；IBT檢測(cè)ANAs，陽(yáng)性723例，占檢測(cè)總數(shù)的31.2%，而同時(shí)檢測(cè)ANA和ANAs，陽(yáng)性共914例，占檢測(cè)總數(shù)的39.4%。IIF檢測(cè)ANA可應(yīng)用于大范圍的AID患者初篩并減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及實(shí)驗(yàn)室工作壓力，但僅檢測(cè)ANA或ANAs均可導(dǎo)致臨床患有AID或潛在AID患者的漏檢，聯(lián)合檢測(cè)則可顯著提高陽(yáng)性檢出率，從而降低現(xiàn)癥及潛在AID患者的漏檢率［2］。本文結(jié)果顯示，聯(lián)合檢測(cè)ANA和ANAs，陽(yáng)性檢出率明顯高于單獨(dú)ANA或ANAs檢測(cè)。筆者還對(duì)650例樣本同時(shí)用IIF和IBT檢測(cè)ds－DNA，其中IIF陽(yáng)性14例（2.2%），IBT陽(yáng)性24例（3.7%），兩組間比較，陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝8.9，P＜0.05）；而IIF和IBT同時(shí)陽(yáng)性?xún)H有8例，可見(jiàn)如果單獨(dú)用其中一種方法檢測(cè)，可能出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，而兩種方法聯(lián)合起來(lái)可以最大限度的避免此類(lèi)問(wèn)題。

聯(lián)合ANA陽(yáng)性熒光模型和ANAs出現(xiàn)的抗原多肽，是診斷和鑒別自身免疫性疾病的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。ANA檢測(cè)以抗原譜完整的Hep－2細(xì)胞為基質(zhì)，針對(duì)細(xì)胞靶抗原的特異抗體可產(chǎn)生特定的熒光模型，而后者與某些疾病有關(guān)［3～5］。本文結(jié)果顯示，740例ANA陽(yáng)性樣本的熒光分型以核顆粒型最常見(jiàn)，占56.08%，其次是均質(zhì)型，占19.32%，部分樣本還可見(jiàn)2種或2種以上核型，每種核型的代表性抗體各不相同，因此核型分型有助于縮小靶抗原確認(rèn)的試實(shí)驗(yàn)范圍；同時(shí)檢測(cè)ANAs，可發(fā)現(xiàn)在每一種ANA核型中，有一種或幾種靶抗原存在。本文中核顆粒型相對(duì)應(yīng)的抗原多肽以抗SSA、抗Ro52、抗nRP／Sm出現(xiàn)的頻率最高，由此可以推論這3種靶抗原應(yīng)該是核顆粒型的代表性多肽（靶）抗原，而其他核型的代表性多肽（靶）抗原也可以根據(jù)其抗原多肽出現(xiàn)的頻率進(jìn)行推測(cè)。本文分析中發(fā)現(xiàn)有ANAs陽(yáng)性者中出現(xiàn)核型不一致的情況，ANA陰性但出現(xiàn)ANAs特異性抗體陽(yáng)性，這可能與血清中其他抗體效價(jià)較強(qiáng)，使不一致抗體在IIF分析中被遮蔽有關(guān)［6］；或者Hep－2細(xì)胞不是某些抗體的最佳檢測(cè)基質(zhì)；如固定不當(dāng)，SSA等可溶性抗原可被洗去而出現(xiàn)IIF分析的假陰性［7，8］。IBT檢測(cè)ANAs的特異性抗體，在反應(yīng)膜條上平行包被多種高度純化或重組的抗原物質(zhì)，一次可檢測(cè)多種與自身免疫性疾病診斷相關(guān)的特異性自身抗體。但同時(shí)抗核抗體譜免疫印跡法也存在著較高的漏檢率，其原因分析為，該譜只含有與常見(jiàn)自身免疫性疾病相關(guān)的抗核抗體，而不代表全部抗核抗體。此外，該免疫印跡法也存在一定的錯(cuò)檢率，這可能與血清處理不當(dāng)，產(chǎn)生非特異性吸附有關(guān)。

有學(xué)者提出ANA檢測(cè)選擇原則［9，10］，通 常首先采用以HEp－2細(xì)胞為抗原基質(zhì)片的間接免疫熒光技術(shù)（IFA）進(jìn)行篩查實(shí)驗(yàn)，陰性結(jié)果結(jié)合臨床一般可以排除自身免疫性疾病的存在，若ANA陽(yáng)性還必須進(jìn)一步篩查ANAs和抗雙鏈DNA（ds－DNA），以期對(duì)疾病做出明確診斷。本文同時(shí)檢測(cè)了ANA抗體、dsDNA和ANAs，結(jié)果表明ANA檢測(cè)選擇原則是正確的，但筆者也認(rèn)為，同時(shí)用IIF和IBT檢測(cè)ANA和ANAs，不僅可以減少陽(yáng)性漏檢率，而且還可對(duì)臨床診斷提供更有力的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

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