人腦膠質瘤細胞中半乳糖凝集素3和整合素αvβ3及基質金屬蛋白酶2 mRNA的表達及意義

王玉玨，李云超，莊雅娟，邱 虹，陳 廣，于向東

膠質瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且療效不佳。本研究采用原位雜交組織化學技術(ISHH)檢測正常腦組織及不同級別膠質瘤細胞中半乳糖凝集素3(galectin-3)、整合素αvβ3及基質金屬蛋白酶2(MMP-2)mRNA的表達，了解三者在腦膠質瘤中的表達規(guī)律，并初步探討三者在分子水平方面對膠質瘤發(fā)生、進展、浸潤以及血管生成中的作用，從分子水平角度為臨床提供評價預后及靶向治療的新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012—2013年河北聯(lián)合大學附屬開灤總醫(yī)院病理科存檔的經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的膠質瘤標本40例，其中男26例，女14例；年齡13～68歲，平均(46±16)歲，中位年齡49歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標準(2000年)，將40例標本進行分級：Ⅰ級12例，Ⅱ級11例，Ⅲ級13例，Ⅳ級4例，Ⅰ、Ⅱ級為低度惡性膠質瘤組，Ⅲ、Ⅳ級為高度惡性膠質瘤組。另取同期同一醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦創(chuàng)傷患者內減壓術中得到的5例正常腦組織標本，其中男3例，女2例；年齡35～53歲，中位年齡44歲。

1.2 方法 標本制備：所有標本經(jīng)4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，蠟塊連續(xù)切片，片厚4 μm，連續(xù)做3張切片，在55 ℃高壓過的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中展片，用原位雜交專用載玻片撈片。3張切片分別用于galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA的原位雜交。galectin-3原位雜交試劑盒、整合素αvβ3原位雜交試劑盒、MMP-2原位雜交試劑盒均來自武漢博士得生物工程有限公司。3個指標的多相寡核苷酸探針序列見表1。

檢測方法如下：(1)60～65 ℃烤片2～4 h至蠟融化為止。(2)切片經(jīng)二甲苯脫蠟20 min 2次，脫蠟后的切片在100%、90%、80%乙醇中分別放置20 min后，經(jīng)DEPC水、磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，5 min/次。(3)3%過氧化氫(H2O2)室溫浸泡5～10 min，DEPC水漂洗3次，5 min/次。(4)暴露mRNA核酸片段：每張切片上滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶，37 ℃消化20 min，0.02 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次，DEPC水漂洗1次，約5 min。(5)后固定：0.1 mol/L PBS(pH 7.2～7.6)室溫固定10 min，DEPC水漂洗3次，5 min/次。(6)預雜交：每張切片加20 μl預雜交液恒溫箱42 ℃ 3 h，吸取多余液體，不洗。(7)雜交：每張切片加入20 μl雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護膜揭開后，蓋在切片上，膠帶封閉濕盒，恒溫箱42 ℃雜交過夜。(8)雜交后洗滌：揭掉蓋玻片，37 ℃水溫的核酸雜交漂洗液(高張力，2×SSC)漂洗2次，5 min/次，37 ℃水溫的核酸雜交漂洗液(低張力，0.5×SSC)漂洗1次，約15 min，37 ℃水溫的0.2×SSC漂洗1次，約15 min，注意濕盒濕度，防止干片。(9)滴加封閉液：37 ℃孵育30 min后，甩去多余液體，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛37 ℃孵育60 min后，0.02 mol/L PBS漂洗4次，5 min/次。(11)滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(SABC)：37 ℃孵育20 min后，0.02 mol/L PBS漂洗3次，5 min/次。(12)滴加生物素化過氧化物酶：37 ℃孵育20 min后，0.02 mol/L PBS漂洗4次，5 min/次。(13)二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色：使用新鮮配置的DAB顯色劑，加至標本上。顯色3～10 min。(14)蘇木素復染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。(15)光學顯微鏡下觀察。陰性對照：采用探針陰性對照，除雜交液不含探針外，其余成分相同。顯微鏡下根據(jù)瘤細胞中galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA陽性細胞數(shù)判斷其表達陽性細胞計數(shù)，以陽性指數(shù)(LI)表示，LI=陽性細胞數(shù)/瘤細胞總數(shù)×100%。

表1 Galectin-3、整合素αvβ3和MMP-2多相寡核苷酸探針序列

Table1 Galectin-3，integrin αvβ3and MMP-2 polyphase oligonucleotide probe sequence

多相寡核苷酸探針序列galectin-3(1)5′-CTTCCACTTTAACCCACGCTTCAATGAGAA-3′(2)5′-AATAACTGGGGAAGGGAAGAAAGACAGTCG-3′(3)5′-AAACCATTCAAAATACAAGTACTGGTTGAA-3′整合素αvβ3(1)5′-CGTTTCAGTGTGCACCAGCAGTCAGAGATGGATAC-3′(2)5′-ACTGAGACTTTTATGAATAAAGAAAATCAGAATCA-3′(3)5′-CATTCAGCCAGCGCCCATGACTGTGCCTGTGTGGG-3′MMP-2(1)5′-TTCTATGGCTGCCCCAAGGAGAGCTGCAAC-3′(2)5′-GACAGCCCTGCAAGTTTCCATTCCGCTTCC-3′(3)5′-GAACCAAAGTCTGAAGTGCGTGAAGTTTGG-3′

注：galectin-3=半乳糖凝集素3，MMP-2=基質金屬蛋白酶2

1.3 結果判定 Galectin-3、整合素αvβ3mRNA以腫瘤細胞的胞質中出現(xiàn)棕色或棕黃色染色為陽性雜交信號。MMP-2 mRNA以腫瘤細胞及血管基底膜內皮細胞的胞質出現(xiàn)棕色或棕黃色染色為陽性雜交信號。根據(jù)陽性細胞數(shù)進行陽性程度分級：陽性細胞數(shù)≤4%為陰性(-)；陽性細胞數(shù)5%～10%為弱陽性(+)；陽性細胞數(shù)11%～49%為陽性(++)；陽性細胞數(shù)≥50%為強陽性(+ + +)。

2 結果

2.1 Galectin-3 mRNA的表達 正常腦組織中galectin-3 mRNA無表達(見圖1)。在人腦膠質瘤中galectin-3 mRNA主要表達于腫瘤細胞的胞質，其表達是在胞質中出現(xiàn)棕色或棕黃色染色(見圖2、3)。在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中，galectin-3 mRNA表達陽性2例、弱陽性4例、陰性17例，LI為(4.8±3.2)%；在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本中，galectin-3 mRNA表達強陽性4例、陽性6例、弱陽性1例、陰性6例，LI為(27.3±22.7)%。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中galectin-3 mRNA的LI與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.055，P<0.05)。

2.2 整合素αvβ3mRNA的表達 正常腦組織中整合素αvβ3mRNA無表達(見圖4)。在人腦膠質瘤中整合素αvβ3mRNA主要表達于腫瘤細胞的胞質，其表達是在胞質中出現(xiàn)棕色或棕黃色染色(見圖5、6)。在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中，整合素αvβ3mRNA表達陽性3例、弱陽性4例、陰性16例，LI為(5.4±3.8)%；在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本中，整合素αvβ3mRNA表達強陽性4例、陽性6例、弱陽性3例、陰性4例，LI為(29.2±21.1)%。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中整合素αvβ3mRNA的LI與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.613，P<0.05)。

2.3 MMP-2 mRNA的表達 正常腦組織中MMP-2 mRNA無表達(見圖7)。在人腦膠質瘤中MMP-2 mRNA主要表達于腫瘤細胞及血管基底膜內皮細胞的胞質，其表達是在胞質中出現(xiàn)棕色或棕黃色染色(見圖8～10)。在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中，MMP-2 mRNA表達陽性5例、弱陽性3例、陰性15例，LI為(6.4±5.3)%；在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本中，MMP-2 mRNA表達強陽性4例、陽性7例、弱陽性1例、陰性5例，LI為(29.9±24.0)%。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤標本中MMP-2 mRNA的LI與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤標本比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.966，P<0.05)。

圖1 Galection-3 mRNA在正常腦組織中無表達(ISHH，×400)

Figure1 No positive stain of galectin-3 mRNA in normal brain tissue

圖2 Galection-3 mRNA在低度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure2 Positive stain of galectin-3 mRNA in tumor cell plasma of low grade glioma

圖3 Galection-3 mRNA在高度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure3 Positive stain of galectin-3 mRNA in tumor cell plasma of high grade glioma

圖4 整合素αvβ3mRNA在正常腦組織中無表達(ISHH，×400)

Figure4 No positive stain of integrinαvβ3mRNA in normal brain tissue

圖5 整合素αvβ3mRNA在低度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure5 Positive stain of integrinαvβ3mRNA in tumor cell plasma of low grade glioma

圖6 整合素αvβ3mRNA在高度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure6 Positive stain of integrinαvβ3mRNA in tumor cell plasma of high grade glioma

圖7 MMP-2 mRNA在正常腦組織中無表達(ISHH，×400)

Figure7 No positive stain of MMP-2 mRNA in normal brain tissue

圖8 MMP-2 mRNA在低度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure8 Positive stain of MMP-2 mRNA in tumor cell plasma of low grade glioma

圖9 MMP-2 mRNA在高度惡性膠質瘤細胞胞質內陽性表達(ISHH，×400)

Figure9 Positive stain of MMP-2 mRNA in tumor cell plasma of high grade glioma

圖10 MMP-2 mRNA在高度惡性膠質瘤血管內皮細胞陽性表達(ISHH，×400)

Figure10 Positive stain of MMP-2 mRNA in vascular endothelial cell of high grade glioma

2.4 Galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA表達的相關性分析 繪制3個指標的三維散點圖，以揭示它們之間的相關性(見圖11)。結果顯示，galectin-3 mRNA的表達與整合素αvβ3、MMP-2 mRNA的表達均呈正相關(r值分別為0.718和0.790，P<0.05)；整合素αvβ3mRNA的表達與MMP-2 mRNA的表達呈正相關(r=0.812，P<0.05)。

圖11 Galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA表達的兩兩相關性散點圖

Figure11 Scatter diagram of correlation between galectin-3，integrin αvβ3and MMP-2 mRNA expression

3 討論

Galectin-3是一個31 kD的β半乳糖蛋白，存在于細胞內和細胞外，主要與細胞內的糖蛋白、細胞表面分子和細胞外基質(ECM)作用，降低腫瘤細胞與ECM的黏附，從而促進腫瘤細胞侵襲，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的全過程[1]。Bresalier等[2]于1997年首先用免疫組化方法研究42例膠質瘤galectin-3表達，發(fā)現(xiàn)低級別的膠質瘤呈低表達，高級別的間變性星形細胞瘤和膠母細胞瘤呈高表達，提示galectin-3的表達水平與病理分級呈正相關，即隨著惡性程度增加而增加[3]；膠質瘤浸潤帶內5%以上的細胞表達galectin-3，而正常腦組織內不表達，這表明galectin-3在腫瘤對周圍組織的侵襲中起重要作用。Kuklinski等[4]應用RT-PCR及Western blotting法檢測galectin-3 mRNA在膠質瘤細胞的表達，結果表明：galectin-3 mRNA選擇性地在高級別星形細胞瘤和少突膠質細胞瘤表達。Camby等[5]的體外實驗研究結果表明：galectin-3 mRNA與膠質瘤的浸潤、遷移有關。本研究檢測不同級別人腦膠質瘤細胞galectin-3 mRNA表達的陽性率及LI，結果發(fā)現(xiàn)Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤細胞galectin-3 mRNA的LI顯著高于Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤，而正常腦組織內無galectin-3 mRNA表達。本研究結果與上述報道一致，因此本研究認為galectin-3 mRNA表達失調可能是膠質瘤間變的一個重要標志，是膠質瘤細胞從分子水平獲得侵襲能力的標志，這也與膠質瘤的生物學特性相符合。Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤屬于惡性程度較低的腫瘤，生長較為局限，患者術后生存期較長。Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤多呈浸潤性生長，易發(fā)生侵襲和轉移，患者臨床預后差。從分子角度來說，膠質瘤惡性程度越高，galectin-3 mRNA表達量越多，越有利于膠質瘤細胞在分子水平侵襲性生長，從而促進腫瘤的浸潤和轉移。

細胞黏附分子(CAM)是一類調節(jié)細胞與細胞、細胞與ECM間相互結合、相互作用的一類細胞膜表面糖蛋白，其參與許多生理和病理過程中細胞間信號的傳導，包括腫瘤細胞的轉移和生長[6]。整合素αvβ3是重要的CAM，在細胞與ECM間的黏附及信息傳遞中發(fā)揮很重要的作用，參與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展的全過程。整合素αvβ3又稱玻璃體結合蛋白受體(VN)[7]，是一種具有多種功能的整合素分子。能識別玻璃體結合蛋白上的RGD。細胞表面的整合素αvβ3與配體結合后，可介導細胞黏附和信號轉導，從而在腫瘤的浸潤和轉移中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞表面的整合素αvβ3細胞黏附受體與ECM成分黏附所致的腫瘤細胞游離或通過基底膜過程，是惡性腫瘤浸潤性生長和遠處轉移的始動步驟[8]。Bello等[9]采用Western blotting法及免疫組化方法研究了40例腦膠質瘤及10例正常腦組織的整合素αvβ3的表達，發(fā)現(xiàn)整合素αvβ3在正常腦組織不表達，在膠質瘤的星形細胞表達，且其表達水平與膠質瘤的惡性程度及組織學類型密切相關，表明整合素αvβ3與膠質瘤的浸潤及轉移密切相關。有文獻報道，整合素αvβ3在膠質瘤組織中表達，同ECM相互作用，參與膠質瘤的浸潤及轉移過程[10]。郭衍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，整合素αvβ3與膠質瘤的惡性程度呈正相關，促進膠質瘤的浸潤及轉移。本研究檢測不同級別膠質瘤標本中整合素αvβ3mRNA表達的陽性率及LI，結果顯示Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤細胞整合素αvβ3mRNA的LI顯著高于Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤，而正常腦組織內無整合素αvβ3mRNA表達。本研究結果與上述報道一致，因此本研究認為整合素αvβ3mRNA表達失調也可能是膠質瘤間變的一個重要標志，是膠質瘤細胞從分子水平獲得侵襲能力的標志，符合膠質瘤的生物學特性?？梢姡z質瘤惡性程度越高，整合素αvβ3mRNA表達量越多，越有利于膠質瘤細胞侵襲性生長，促進腫瘤的浸潤和轉移。本研究提示，整合素αvβ3mRNA可以作為膠質瘤惡性及侵襲程度的參考指標；對膠質瘤從分子水平方面進行的檢測，在判斷腫瘤惡性程度及預后方面可能具有更重要的意義。

膠質瘤的生物學行為和預后同腫瘤細胞的侵襲程度密切相關。腫瘤細胞在侵襲過程中必須破壞由細胞間基質及基膜構成的ECM屏障。在ECM的酶類中，基質金屬蛋白酶(MMPs)與腫瘤侵襲的關系最為密切[12-13]。Yamamoto等[14]研究表明，具有侵襲能力的膠質瘤細胞可分泌大量的MMP-2，同時其侵襲力與MMP-2表達水平存在密切關系——惡性程度越高，MMP-2表達水平亦明顯增高。Sawaya等[15]體內試驗發(fā)現(xiàn)，MMP-2蛋白表達水平與人腦星形膠質細胞瘤級別呈正相關。另有研究也表明，MMP-2與膠質瘤的侵襲性有很大的相關性，具有侵襲能力的膠質瘤細胞分泌大量的MMP-2，其侵襲能力同MMP-2表達水平呈正相關，隨著膠質瘤惡性程度的增高，MMP-2 mRNA轉錄和表達水平亦明顯上調[16]。本研究結果顯示，Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤細胞MMP-2 mRNA的LI顯著高于Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤，而正常腦組織內無表達。本研究結果與上述報道一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2 mRNA在膠質瘤基質中表達主要位于血管內皮細胞。提示MMPs與膠質瘤的血管生成有關，而膠質瘤血管生成是其侵襲的必要條件。膠質瘤侵襲生長時必須有腫瘤血管形成來為其提供營養(yǎng)，腫瘤血管又可促進其侵襲，腫瘤細胞可沿新生血管開啟的裂隙向外侵入周圍組織，這也是膠質瘤侵襲的主要方式之一。Vince等[17]運用原位雜交方法研究膠質瘤血管形成，發(fā)現(xiàn)MMP-2 mRNA表達主要位于血管內皮細胞，參與膠質瘤血管形成過程，本研究結果與之一致。因此本研究認為，MMP-2 mRNA表達失調是膠質瘤細胞獲得侵襲能力的標志，符合膠質瘤的生物學特性?？梢姡z質瘤惡性程度越高，MMP-2 mRNA表達量越多，在分子水平方面越有利于膠質瘤細胞侵襲性生長，促進腫瘤的浸潤和轉移。本研究提示，檢測膠質瘤組織中MMP-2 mRNA表達，對于臨床上從分子水平預測膠質瘤的惡性程度、侵襲性及判斷預后具有一定的指導意義。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA的表達均互相呈正相關，共同為腫瘤的浸潤生長創(chuàng)造有利的生存內環(huán)境。其機制可能為：(1)galectin-3的功能性糖識別域可與整合素α1β1上的半乳糖殘基結合，調節(jié)腫瘤細胞與ECM的結合，高濃度的galectin-3可導致整合素與ECM配體的結合障礙，從而調節(jié)細胞黏附，促進腫瘤細胞的浸潤[18]；(2)整合素αvβ3是通過調控MMP-2的生成和激活對基質蛋白進行降解，從而促進腫瘤細胞的浸潤與轉移[19]；(3)galectin-3又是MMP-2的底物，MMP-2將galectin-3分解后產(chǎn)生1個分子質量為22 kU的糖識別域和1個分子質量為9 kU的氨基酸殘基組成galectin-3末端片段，該片段可以與MMP-2結合促進腫瘤的浸潤與轉移[20]。

綜上所述，galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA從分子水平共同促進膠質瘤的發(fā)展、浸潤及血管生成，三者之間起協(xié)同作用。因此，聯(lián)合檢測腦膠質瘤中galectin-3、整合素αvβ3、MMP-2 mRNA的表達，可從分子水平預測膠質瘤的惡性程度、侵襲性，為預后判斷提供參考依據(jù)。

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