透明質酸對體外培養(yǎng)的大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞透明質酸合成酶2 mRNA表達的影響

高宗強，郭 雄，陳君長，段 琛，馬瑋娟，劉瑞宇，顧其勝

大骨節(jié)病是一種慢性變形性、地方性的骨關節(jié)病，嚴重危害了病區(qū)人群的健康，目前其發(fā)病原因及機制尚不清楚[1]，其與骨關節(jié)炎具有相似的臨床癥狀、體征及關節(jié)軟骨病理學變化，尚無有效的促進軟骨修復的方法。盡管在最新美國骨科醫(yī)師學會(AAOS)骨關節(jié)炎指南中，對骨關節(jié)炎患者關節(jié)腔注射透明質酸不予推薦，但在既往臨床中，大量病例證實膝關節(jié)腔注射透明質酸鈉可有效緩解大骨節(jié)病、骨關節(jié)炎的癥狀與體征[2-7]。關節(jié)炎患者關節(jié)液中，透明質酸含量下降，分子量減小，但軟骨細胞自身合成、分泌透明質酸的能力有無變化，相關研究較少。補充外源性透明質酸，對軟骨細胞自身合成、分泌透明質酸又有何影響，目前亦無相關研究。本課題選擇在透明質酸合成酶中至關重要的合成酶2基因作為軟骨細胞透明質酸合成能力的觀測指標,將大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞和正常軟骨細胞比較，觀察病理狀態(tài)下軟骨細胞透明質酸合成酶2(HAS2)mRNA表達有何變化，并觀察外源性透明質酸干預對軟骨細胞自身透明質酸合成的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2006年8月—2008年7月陜西地方病研究所明確診斷大骨節(jié)病，并實施膝關節(jié)游離體摘除術后取出的游離體及關節(jié)軟骨6例為大骨節(jié)病組，其中男3例，女3例；年齡35～47歲；西安市紅十字會醫(yī)院明確診斷骨關節(jié)炎，并行全膝關節(jié)置換術后的膝關節(jié)軟骨6例為骨關節(jié)炎組，其中男3例，女3例；年齡57～73歲。符合我國大骨節(jié)病臨床診斷標準(GB16003-1995)[8-9]和美國風濕病協(xié)會骨關節(jié)炎診斷標準(1995年版)[10]診斷大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎。另選擇同時期由于車禍等意外原因截肢或身亡者的新鮮膝關節(jié)軟骨6例為對照組，其中男4例，女2例；年齡27～39歲；取材部位與大骨節(jié)病、骨關節(jié)炎患者一致，均排除了類風濕性關節(jié)炎等其他關節(jié)疾患。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)；小牛血清(蘭州明海生物制品有限公司)；胰蛋白酶、透明質酸酶、Ⅱ型膠原酶、MTT、 DMSO(SIGMA公司，美國)；AnnexinⅤ-PI染液(深圳晶美生物工程有限公司)；透明質酸鈉(上海其勝生物制劑有限公司)；Shel-Lable CO2培養(yǎng)箱(Shel-Lable公司，美國)；倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)；Nikon雙目光學顯微鏡及纖維照相系統(tǒng)(日立公司，日本)；RNAfast200-總RNA 極速抽提試劑盒(上海飛捷生物技術有限公司)；cDNA反轉錄試劑盒(MBI公司，美國)；PCR mix(MBI公司，美國)；引物合成 (北京奧科生物技術有限責任公司)；Agarose瓊脂糖(solarbio分裝)；DL2000Marker (北京萬農先鋒生物技術公司)；

本研究創(chuàng)新點——

本研究對體外培養(yǎng)的人大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎軟骨細胞采用不同劑量的透明質酸進行干預，檢測干預前后軟骨細胞自身透明質酸合成酶2基因mRNA的水平變化，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎的軟骨細胞透明質酸合成酶2表達均有所下降，且骨關節(jié)炎下降更明顯。補充外源性透明質酸后，發(fā)現(xiàn)各組軟骨細胞自身合成透明質酸的能力均有增加的趨勢，盡管差異無統(tǒng)計學意義，但也為下一步的實驗和臨床使用透明質酸提供了一定的參考。對于大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者透明質酸合成酶2基因的相關研究，目前尚屬于空白。

PCR儀(ASTEC公司，日本)；GeneGenius全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(SynGene公司，英國)。

1.3 軟骨細胞的分離與培養(yǎng)

1.3.1 原代細胞的分離與培養(yǎng) 關節(jié)置換術后4 h或死亡后12 h內，在無菌條件下取出關節(jié)軟骨，并轉移至無血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中帶入超凈臺，將軟骨切為1 mm×1 mm的骨粒，先加入10 ml 0.2%的胰蛋白酶，將其放置在37 ℃的搖床上消化1 h，之后加入10 ml 0.1%透明質酸酶消化1 h，最后加入10 ml 0.2%的Ⅱ型膠原酶消化4 h，收集含有細胞的上清液，進行離心，離心后吸取上清的膠原酶重新加入錐形瓶中，對其余的軟骨塊進行消化。重復收集細胞3次，將收集的細胞放入200目的濾網(wǎng)中進行過濾，過濾后進行收集離心。離心后放入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中重新懸浮。得到原代細胞后，按照40萬/瓶的密度進行接種，加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中含青霉素、鏈霉素各100 U/ml，將培養(yǎng)瓶置于5%CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。培養(yǎng)2～3 d后觀察：關節(jié)軟骨細胞呈多變性，并有細胞少數(shù)貼壁。在培養(yǎng)過程中，可在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。原代細胞在培養(yǎng)箱中72 h后更換培養(yǎng)液，之后每隔48 h進行換液，培養(yǎng)3～4周后形成細胞單層。

1.3.2 傳代培養(yǎng) 待原代培養(yǎng)的細胞長滿后，棄去瓶中的培養(yǎng)液，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞后，加入2 ml 0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化液，在倒置顯微鏡下觀察細胞，待細胞明顯皺縮、變圓后加入培養(yǎng)液停止消化，之后吹打懸浮液，收集細胞懸浮液進行離心，離心后按照40萬/瓶的密度將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入37 ℃的CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基，待細胞長滿后，消化細胞，進行下面實驗。

1.4 RNA的提取 消化長滿的1代細胞，按照20×104/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2 ml培養(yǎng)液，每個病例接種一板，在接種48 h后更換培養(yǎng)基：吸去原培養(yǎng)基，分別加入2 ml含不同劑量透明質酸鈉的培養(yǎng)液，每個6孔板分為3組，分別為H0(0 μg/ml)、H100(100 μg/ml)和H500(500 μg/ml)，隔天更換培養(yǎng)液，共培養(yǎng)6 d。按RNAfast 200-總RNA極速抽提試劑盒說明書方法提取RNA：每組的兩孔合起在冰上加入500 μl 的RA2液，吹打1 min，使其充分混勻；吸取細胞裂解物置于內套管中，按照12 000 r/min(離心半徑30 cm)，4 ℃下離心1 min；將外套管中的液體棄去，給內套管中加入500 μl洗液離心1 min；重復此過程一次；取出內套管，棄去外套管中液體，仍然套回內套管，不加洗液，按照12 000 r/min(離心半徑30 cm)，4 ℃下離心1 min；將內套管移入新的eppendorf管中，在膜中央加入30 μl洗脫液，于室溫下靜置1 min，離心1 min，最終獲得總RNA。

1.5 RT-PCR檢測 按試劑盒的說明采取一步法反轉錄cDNA。cDNA 鏈擴增目的DNA雙鏈。在冰上的EP管中加入以下反應體系：PCR mix 12.5 μl、反轉錄產物(cDNA) 1 μl、上游引物1 μl、下游引物和無RNA酶的去離子水1 μl，加至25 μl，將上述混合物充分混合，并離心3～5 s。將上述混合物放入PCR儀中進行擴增。HAS2基因上游引物為：5′-ATTGTTGGCTACCAGTTTATCC-3′；下游引物為：5′-CTTTATGTGACTCATCTGTCTC-3′。內參GAPDH上游引物為：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTGGGCC-3′；下游引物為：5′-ACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′。 PCR反應條件為：預變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 30 s，退火53 ℃ 1 min，于70 ℃延伸1 min，共循環(huán)35輪。

1.6 PCR電泳及凝膠成像分析 將PCR產物跑電泳后，使用凝膠成像分析系統(tǒng)攝像，并分析條帶積分光密度(IOD)值，對各組各條帶與內對照GAPDH條帶的IOD值的比值進行分析，從而進行目的mRNA表達的半定量分析。

2 結果

2.1 干預前3組HAS2 mRNA表達比較 干預前3組HAS2 mRNA表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中骨關節(jié)炎組較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 干預后不同劑量間HAS2 mRNA表達比較 干預后不同劑量間HAS2 mRNA表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2、圖1)。

Table1 Comparison of HAS2 mRNA expression levels among 3 groups of chondrocytes before treatment

組別例數(shù)HAS2mRNA對照組60654±0018 大骨節(jié)病組60610±0027 骨關節(jié)炎組60552±0099?F值4371P值0032

注：HAS2=透明質酸合成酶2；與對照組比較，*P<0.05

Table2 Comparison of HAS2 mRNA expression levels among different dose groups of chondrocytes after treatment

組別例數(shù)對照組大骨節(jié)病組骨關節(jié)炎組H0組60654±00180610±00270552±0099H100組60720±01480620±00600492±0216H500組60686±00790663±00370572±0029F值068424690550P值052001180588

注：1、2、3為對照組H0、H100、H500；4、5、6為大骨節(jié)病組H0、H100、H500； 7、8、9為骨關節(jié)炎組H0、H100、H500

圖1 透明質酸鈉干預后各組軟骨細胞HAS2 mRNA PCR擴增產物

Figure1 PCR amplification products of HAS2 mRNA in different groups of chondrocytes after hyluronic acid treatment

3 討論

透明質酸是軟骨細胞外基質的重要組成部分，蛋白聚糖單體正是通過連接蛋白附著于透明質酸鏈上組成聚集蛋白聚糖。其正常的結構和足夠的數(shù)量是保證軟骨基質保持正常形態(tài)結構的基礎。在關節(jié)液中，透明質酸也是重要組成部分，可以有效減少關節(jié)摩擦，增加關節(jié)潤滑度。

在關節(jié)退變時，關節(jié)軟骨中正常的透明質酸鏈發(fā)生降解，附著在透明質酸鏈上的聚集蛋白聚糖同時發(fā)生降解，關節(jié)軟骨依靠大分子蛋白聚糖聚集水分的能力極大下降，含水量的下降導致關節(jié)軟骨的彈性降低，分散壓力的能力下降，更容易出現(xiàn)損傷。同時關節(jié)液中大分子透明質酸逐步降解為小分子透明質酸，并且含量較正常降低，正常的潤滑作用明顯減低。在這也是臨床上關節(jié)腔注射透明質酸治療骨關節(jié)炎和大骨節(jié)病的重要原因。

通過補充外源性透明質酸， 外源性透明質酸能覆蓋于關節(jié)軟骨和滑膜的表面，防止滑液中的各種蛋白酶和炎性遞質通過關節(jié)軟骨表層的“裂痕”進入軟骨基質，從而保護膠原和蛋白多糖免受酶的消化，阻斷關節(jié)退變的發(fā)生。增強關節(jié)滑液的潤滑作用，改善關節(jié)的活動功能。并進入軟骨表層與蛋白多糖結合，修復軟骨?？煞€(wěn)定傷害性感受器，減輕骨關節(jié)炎患者的疼痛癥狀。

透明質酸合成酶(HAS)是一類存在于細胞膜上，能夠特異性作用于透明質酸合成的酶。1996年，美國4個實驗室?guī)缀跬瑫r確認了真核生物的HAS-cDNAs，證實人類HAS基因是多基因家族，其編碼3種同工酶[11]:HAS1、HAS2和HAS3。3種HAS都能在細胞中獨立地催化生成透明質酸，但活性各不相同[12]，最終表現(xiàn)在生理功能上的不同。HAS3的催化活性大于HAS2，HAS2的催化活性又大于HAS1。Toole[13]通過敲除小鼠HAS1或HAS3基因，發(fā)現(xiàn)小鼠仍可以存活，但是敲除HAS2基因時，小鼠卻難以生存。這是因為在小鼠的胚胎發(fā)育期HAS2的缺乏將會導致透明質酸合成不足，引發(fā)嚴重的發(fā)育缺陷，如卵黃囊和心臟缺陷。說明HAS2在發(fā)育中是至關重要的。然而，針對不同分子量透明質酸功能差異的研究，目前仍十分有限。HAS1、HAS2、HAS3差別所具有的生理學意義也不十分清楚[14-15]。有研究表明，HAS2與軟骨形成和排卵有關[16]。

Yoshida等[17]通過對比發(fā)現(xiàn)，類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎患者滑液中HAS1、HAS2表達明顯降低，這也許可以解釋類風濕關節(jié)炎和骨關節(jié)炎滑液中透明質酸的含量和分子量都下降。同樣有研究顯示骨關節(jié)炎患者關節(jié)滑膜中HAS2表達量明顯低于正常對照組[18]；在自體軟骨移植修復軟骨缺損過程中HAS2表達量明顯升高[19]。David-Raoudi等[20]觀察到硫酸軟骨素可以增加骨關節(jié)炎患者滑膜、成纖維細胞分泌高分子量透明質酸，并認為是通過上調HAS1和HAS2來實現(xiàn)的，還發(fā)現(xiàn)白介素1β(IL-1β)可以刺激HAS3的表達，硫酸軟骨素可抑制此過程，增加大分子量透明質酸的分泌。

對于大骨節(jié)病患者中HAS的變化,目前尚無相關研究數(shù)據(jù)。曹佩華等[21]發(fā)現(xiàn)中濃度雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)毒素可顯著促進HAS2 mRNA表達，提示在一定范圍內毒素可刺激關節(jié)軟骨合成透明質酸。在另一項研究中，Li等[22]發(fā)現(xiàn)T-2毒素可以降低HAS2 mRNA表達，似乎不同毒素對關節(jié)軟骨細胞HAS2 mRNA的表達影響不同。

本實驗結果顯示，大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者中HAS2表達量有所降低，表明了在大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎患者軟骨細胞自身透明質酸的合成能力是下降的。這也為臨床上關節(jié)腔注射透明質酸提供了理論基礎。補充外源性透明質酸鈉干預后有一定的促進軟骨細胞HAS2 mRNA表達的趨勢，盡管無統(tǒng)計學差異，但也許能給我們提示，補充外源性透明質酸還能促進軟骨細胞自身透明質酸的合成。這也許能解釋為什么臨床上關節(jié)腔注射透明質酸鈉后，療效仍能長時間維持。

正是由于高分子量透明質酸在退變關節(jié)中作用明顯，而內源性透明質酸又主要是由HAS2催化生成的，Zhang等[23]提出設想，可將HAS2基因轉染入關節(jié)，也許可以長期有效地刺激內源性高分子量的透明質酸產生，與傳統(tǒng)的關節(jié)內注射透明質酸鈉相比，作用時間更為持久，可有效避免因反復注射帶來的并發(fā)癥，具有很好的臨床應用前景，也許可作為治療骨關節(jié)炎的一個新途徑，并于2007年成功地構建了pEGFP-N3-HAS2真核表達載體，并證實經(jīng)該載體瞬時轉染的HEK293細胞，可高效表達HAS2-EG-FP融合蛋白。

提示，也許可以將HAS2基因作為大骨節(jié)病和骨關節(jié)炎治療方面一個新的基因靶點。

本實驗也有一定的缺陷，至于外源性透明質酸干預后只有變化的趨勢，沒有統(tǒng)計學差異，可能與樣本量過小，而且，早期實驗條件所限，采用的是半定量的RT-PCR有關，沒有采用更為客觀的實時定量PCR，影響了實驗數(shù)據(jù)的精確性，且缺乏蛋白方面的驗證。但添加外源性透明質酸后促進軟骨細胞自身HAS2基因表達的趨勢，也能給臨床使用透明質酸提供一定的參考。

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