響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取草魚魚鱗膠原蛋白的研究

張璟晶，唐勁松，王海波，力朝洲，馮曉蕊

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇泰州225300）

響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取草魚魚鱗膠原蛋白的研究

張璟晶，唐勁松，王海波，力朝洲，馮曉蕊

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院食品科技學(xué)院，江蘇泰州225300）

以草魚魚鱗為原料，用木瓜蛋白酶解提取草魚魚鱗中的膠原蛋白，并對其性質(zhì)進行初步研究。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法Box-Behnken試驗設(shè)計，對影響提取率的酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分數(shù)3個因素進行優(yōu)化，建立并分析各因素與膠原蛋白提取率關(guān)系的數(shù)學(xué)模型。確定木瓜蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白的最佳條件為酶解溫度50℃，加酶量3.5 g/L，底物質(zhì)量分數(shù)22%，經(jīng)過驗證膠原蛋白提取率為15.4%。得到魚鱗膠原蛋白吸水性接近于甘油，保水性優(yōu)于甘油，具有一定的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

魚鱗；膠原蛋白；響應(yīng)面法；提?。恍再|(zhì)研究

我國每年魚的廢棄物總量超過200萬t，其中魚鱗約占15%[1]。魚鱗中主要成分是蛋白質(zhì)和羥基磷灰石，而蛋白質(zhì)組成中又以膠原蛋白為主[2]。據(jù)報道，魚鱗膠原蛋白可制成可食性蛋白膜[3]，用于香腸、糖果、糕點等的制作，還可以作為乳化劑、增稠劑、發(fā)泡劑、膠凝劑等添加到肉制品等產(chǎn)品中[4]，水解得到的魚鱗膠原蛋白肽也可作為調(diào)味品和功能性食品的添加劑[5]。魚鱗膠原的降解產(chǎn)物也具有抗氧化、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等保健功能[6-8]。所以魚鱗中膠原蛋白的提取和應(yīng)用有很好的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。

目前國內(nèi)外研究大都集中在優(yōu)化熱浸提，酸法，堿性蛋白酶法提取膠原蛋白的工藝研究[9]。酶法提取魚鱗膠原蛋白能很好的增加提取率，而且木瓜蛋白酶相對對膠原作用較弱，只對膠原蛋白的非螺旋端肽，而不會對螺旋區(qū)進行水解，提取得到的酶溶性蛋白仍能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，對于膠原蛋白中特有的羥脯氨酸以肽的形式的保存率＞96%[10]。本實驗利用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取魚鱗膠原蛋白，旨在提高草魚魚鱗的膠原蛋白提取率，以期為充分利用草魚魚鱗資源，減少環(huán)境污染提供依據(jù)，并對提取的魚鱗膠原蛋白性質(zhì)進行初步研究，為其在食品加工中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

草魚魚鱗：購于泰州農(nóng)貿(mào)市場，清洗后瀝干，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗試劑

木瓜蛋白酶（酶活力3 000 U/g）：上海聚源生物有限公司；乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、羥脯氨酸、氯胺-T、對-二甲胺基苯甲醛、乙醇等均為分析純：上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HHS-11-2電熱式恒溫水浴鍋：江蘇金壇宏凱儀器廠；EL3002型精密電子天平：梅特勒-托多利儀器（上海）有限公司；DFT-100高速萬能粉碎機：上海新諾儀器設(shè)備有限公司；BGZ-240電熱鼓風(fēng)干燥箱、722型分光光度計：上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚鱗前處理

將魚鱗用流水清洗瀝干后于1%鹽酸中浸泡24 h，不時攪拌，中間換鹽酸液一次。清水漂洗數(shù)次后置于2.5%氯化鈉溶液中浸泡24 h，中間換氯化鈉溶液一次。用自來水洗滌后再用蒸餾水洗滌，晾干備用。

1.3.2 魚鱗膠原蛋白提取工藝[11-12]

1.3.3 單因素試驗

準確稱取經(jīng)處理的5.0 g魚鱗粉末，加蒸餾水制成混懸液，加入木瓜蛋白酶酶解。以膠原蛋白提取率為考察指標，對酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分數(shù)進行單因素試驗。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白提取率為優(yōu)化目標，選擇酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分數(shù)三個因素，利用Design Expert 8.0軟件，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法，設(shè)計了3因素3水平共17個試驗點的響應(yīng)面試驗[13-14]。響應(yīng)面試驗因素水平編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface method

1.3.5 魚鱗膠原蛋白提取率的測定

羥脯氨酸為膠原蛋白特有的氨基酸，羥脯氨酸的含量與膠原蛋白的含量成正比關(guān)系[10]，膠原蛋白的提取率計算公式：

按照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》的方法測定羥脯氨酸的含量。取羥脯氨酸0.001 g定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的母液，并以此稀釋至5 μg/mL、4 μg/mL、3 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，測定波長為558 nm，以測定的吸光度值（y）為縱坐標，羥脯氨酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標繪制標準曲線，得到標準曲線方程y=0.091 7x+0.012 9，R2=0.999 0。

1.3.6 魚鱗膠原蛋白的部分特性研究

（1）吸水性和保水性的測定

吸水性測定：準確稱取1.0 g魚鱗膠原蛋白樣品，置于已知質(zhì)量的培養(yǎng)皿中，然后將其放入恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)溫度25℃，相對濕度85%，每隔2 h測培養(yǎng)皿質(zhì)量，直至質(zhì)量不再增加，同時用甘油作對照。

式中：M2為培養(yǎng)皿和吸收水分的總質(zhì)量，g；M1為培養(yǎng)皿質(zhì)量，g；W為樣品質(zhì)量，g。

保水性測定：準確量取5 g/L的魚鱗膠原蛋白溶液5 mL于一培養(yǎng)皿中，置于40℃，相對濕度15%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，每隔10 min測定一次樣液的水分含量，同時用甘油作對照。

（2）乳化性和乳化穩(wěn)定性測定

準確量取5 g/L的魚鱗膠原蛋白溶液5 mL，加入10 mL色拉油，均質(zhì)2 min，轉(zhuǎn)移至刻度離心管中進行離心，記錄乳化混合液的體積，通過下式計算魚鱗膠原蛋白的乳化性：

制備的乳化液移入刻度試管內(nèi)，置于50℃水浴鍋中。每隔1 h記錄乳化液體積的變化。通過下式計算魚鱗膠原蛋白的乳化穩(wěn)定性：

1.3.7 水分的測定

水分的測定參照GB 5009.3—2010《食品安全國家標準食品中水分的測定》中的方法進行測定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響

利用木瓜蛋白酶酶解提取魚鱗中的膠原蛋白，在加酶量為3 g/L，底物質(zhì)量分數(shù)為20%時，改變酶解溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，考察不同酶解溫度對膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶解溫度對魚鱗膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on extraction efficiency of collagen

由圖1可知，在一定范圍內(nèi)隨著溫度的提高，膠原蛋白的提取率也逐漸增大。當溫度到達50℃時，提取率達到最大值，之后提取率有所下降。究其原因是隨著溫度的升高，增加了木瓜蛋白酶水解底物的速度，使得膠原蛋白的提取率得到一定的提升，但是過高的溫度也使得酶本身蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，而導(dǎo)致酶的變性，使其催化活性降低。結(jié)果表明，50℃是木瓜蛋白酶提取膠原蛋白的最佳溫度。

2.1.2 加酶量對魚鱗膠原蛋白提取率的影響

用木瓜蛋白酶提取魚鱗中的膠原蛋白，控制酶解溫度50℃，底物質(zhì)量分數(shù)為20%，考察不同的加酶量對魚鱗膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

當?shù)孜锪恳欢ㄇ移渌h(huán)境也完全相同時，加酶量將影響酶解過程的酶解效果。由圖2可知，加酶量為1～2 g/L時，木瓜蛋白酶水解程度增加，魚鱗膠原蛋白的提取率有所增加，但當加酶量＞2 g/L時，隨著加酶量的增加，膠原蛋白的提取率反而有一定程度下降，分析其原因，加酶量過大可能引起了膠原蛋白的過度水解。所以選取加酶量為2 g/L。

2.1.3 底物質(zhì)量分數(shù)對膠原蛋白提取率的影響

用木瓜蛋白酶提取魚鱗中的膠原蛋白，控制酶解溫度在50℃，加酶量為2 g/L，考察不同底物質(zhì)量分數(shù)對魚鱗膠原蛋白提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 底物質(zhì)量分數(shù)對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on extraction efficiency of collagen

由圖3可知，當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)為10%～20%時，膠原蛋白的提取率逐漸升高，但當?shù)孜镔|(zhì)量分數(shù)過大時，則不能最大程度的提取魚鱗中膠原蛋白。因此選擇底物質(zhì)量分數(shù)為20%。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

通過響應(yīng)面法試驗，能分析各因子之間的交互影響，又能建立準確合理的數(shù)學(xué)模型。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以膠原蛋白提取率（Y）為響應(yīng)值，選取酶解溫度、加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)的最佳作用范圍，采用響應(yīng)面法提取酶溶性魚鱗膠原蛋白。結(jié)果見表2。

表2 膠原蛋白提取工藝Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and corresponding experimental results for collagen extraction

采用Design-Expert8.0軟件對表2進行回歸擬合分析，得到回歸方程模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 膠原蛋白提取工藝回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 ANOVA for the regression equation describing the extraction process

由表3可以看出，模型P（0.000 3）＜0.001，達到極顯著水平，失擬P值為0.137 1，不顯著，因此二次模型成立。試驗因子對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項對響應(yīng)值也有很大的關(guān)系，對此進行多元回歸分析，得到多元二次回歸方程模型為：

由表3可以看出，影響木瓜蛋白酶水解提取魚鱗膠原蛋白提取率的因素主次為C＞B＞A，即底物質(zhì)量分數(shù)＞加酶量＞酶解溫度。其中底物質(zhì)量分數(shù)和加酶量對膠原蛋白提取率的影響均達到了顯著水平。并且底物質(zhì)量分數(shù)和酶解溫度，加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)之間有交互作用，作用顯著。模型的相關(guān)系數(shù)R達到了0.981 2，該模型與實際試驗擬合良好。

2.2.2 魚鱗膠原蛋白提取率最優(yōu)工藝參數(shù)的確定

圖4 各因素兩兩交互作用對魚鱗膠原蛋白提取率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on extraction efficiency of collagen

各因素交互作用對魚鱗膠原蛋白提取率影響的等高線和響應(yīng)面圖（圖4）可知，隨著酶解溫度和底物質(zhì)量分數(shù)的增加，魚鱗膠原蛋白提取得率先增大后減少，等高線呈橢圓形，說明酶解溫度和底物質(zhì)量分數(shù)的交互作用對魚鱗膠原蛋白取得率有顯著影響。隨著加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)的增大，提取得率先增大后減小，等高線呈橢圓形，說明加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)對提取得率的影響也顯著。從響應(yīng)面的最高點和等高線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值。

由模型可以得到提取的最優(yōu)條件為酶解溫度50.39℃，加酶量為3.63 g/L，底物質(zhì)量分數(shù)為21.74%，膠原蛋白提取率的理論預(yù)測值可以達到15.604 8%。為了便于實際操作，控制最佳工藝參數(shù)，酶解溫度為50℃，加酶量為3.5 g/L，底物質(zhì)量分數(shù)為22%，經(jīng)過驗證膠原蛋白提取率為15.4%，說明試驗擬合性能良好，該模型合理可行。

2.3 魚鱗膠原蛋白的部分功能特性研究結(jié)果

2.3.1 吸水性與保水性

圖5 魚鱗膠原蛋白與甘油的吸水性(A)及保水性(B)比較Fig.5 Water absorption capacities(A)and water-holding capacities(B)of collagen and glycerol

由圖5可以看出，魚鱗膠原蛋白的吸水性略低于甘油的吸水性，但魚鱗膠原蛋白的保水性優(yōu)于甘油。原因在于魚鱗膠原蛋白具有大量的親水性基團，其獨特的三螺旋結(jié)構(gòu)也有效地保持其水分。

2.3.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性的研究

乳化性是指能將水和油結(jié)合在一起，形成乳狀液的能力，而乳化穩(wěn)定性是指油水乳狀液保持穩(wěn)定的能力。這兩種性質(zhì)決定了乳化劑在食品中的適用性。

圖6 魚鱗膠原蛋白乳化穩(wěn)定性Fig.6 Emulsifying stability of collagen

經(jīng)過測定酶法從魚鱗中提取的膠原蛋白的乳化性為50%，從圖6可知，魚鱗膠原蛋白有一定的乳化穩(wěn)定性。究其原因可能是木瓜蛋白酶的水解作用使處于內(nèi)部的疏水性基團暴露與油相互作用，而親水性基團則與水相互作用，降低了油水兩相界面的張力，使互不相溶的兩相形成了穩(wěn)定的乳濁液。

3 結(jié)論

選用木瓜蛋白酶提取魚鱗中的膠原蛋白，其酶解溫度、加酶量、底物質(zhì)量分數(shù)對魚鱗膠原蛋白提取效果均有影響，影響的大小順序為底物質(zhì)量分數(shù)>加酶量>酶解溫度。其中底物質(zhì)量分數(shù)和加酶量對于膠原蛋白的提取影響達到顯著水平，并且底物質(zhì)量分數(shù)和酶解溫度，加酶量和底物質(zhì)量分數(shù)之間有交互作用。

應(yīng)用Design Expert 8.0統(tǒng)計分析軟件建立了魚鱗膠原蛋白提取率回歸模型：

通過單因素和響應(yīng)面法分析確定提取的最優(yōu)條件為酶解溫度50℃，加酶量3.5 g/L，底物質(zhì)量分數(shù)22%，經(jīng)過驗證，膠原蛋白提取率為15.4%。

對酶解提取到的魚鱗膠原蛋白的性能研究表明，其吸水性接近于甘油，而保水性優(yōu)于甘油，并且具有一定的乳化穩(wěn)定性，可以很好的應(yīng)用于食品工業(yè)中。

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Extraction of collagen from grass carp scale with papain by response surface methodology

ZHANG Jingjing,TANG Jinsong,WANG Haibo,LI Chaozhou,FENG Xiaorui
(Department of Food Science and Technology,Jiangsu Agri-Animal Husbandry Vocational College,Taizhou 225300,China)

The collagen from grass carp scale was extracted with papain,and the collagen properties were studied.On the basis of single factor experiment,Box-Behnken response surface methodology was used to optimize the technical parameters of temperature,enzyme addition and substrate concentration,to establish and analysis the mathematical model between various factors and collagen extraction yield.The optimal parameters were as follows:hydrolysis temperature 50℃,enzyme addition 3.5 g/L,substrate concentration 22%,and verification test showed that the collagen extraction ratio was 15.4%.The water absorption of collagen from grass carp scale was close to glycerin,and the holding water capacity was better than glycerin.The collagen from grass carp scale had good emulsion capacity and emulsion stability.

scales;collagen;response surface methodology;extraction;properties study

TS257.9

A

0254-5071（2014）10-0099-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.024

2014-08-10

2013年江蘇省教育廳大學(xué)生實踐創(chuàng)新訓(xùn)練項目（201312806010Y）

張璟晶（1981-），女，講師，碩士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。