河南煙草鐮刀菌的初步分子鑒定

田艷艷，王偉杰，苗圃，李淑君，康業(yè)斌*

1.河南科技大學林學院，河南省洛陽市天津路70號 471000

2.洛陽市煙草公司嵩縣支公司，河南省洛陽市嵩縣金城路 471400

3.河南省煙草公司煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

河南煙草鐮刀菌的初步分子鑒定

田艷艷1，王偉杰2，苗圃1，李淑君3，康業(yè)斌*1

1.河南科技大學林學院，河南省洛陽市天津路70號 471000

2.洛陽市煙草公司嵩縣支公司，河南省洛陽市嵩縣金城路 471400

3.河南省煙草公司煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)永昌大道 461000

為了明確河南煙田危害煙草的鐮刀菌種類，以煙葉主產(chǎn)區(qū)典型病株為樣本，用組織分離法獲得純菌株，并對所得菌株進行形態(tài)學鑒定、rDNA-ITS序列分析及致病性測定。形態(tài)學觀察結(jié)果表明，分離獲得的22個菌株在PDA培養(yǎng)基上均產(chǎn)生茂密的菌絲，呈棉絮狀，能產(chǎn)生黃、紅、紫等色素，大型分生孢子鐮刀形或橢圓形，無色、多胞；小型分生孢子卵形至橢圓形，無色、單胞或雙胞。BLAST比對結(jié)果表明，在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中，菌株1～11號的DNA序列與登陸號為KC429789.1的Fusarium oxysporum（F.oxysporum）序列同源性達到95.77%以上；菌株12～18號與登陸號為JQ910159.1的Fusarium solani（F.solani）序列的同源性達到88.01%以上；菌株19～21號與登陸號HQ176444.1的Fusarium verticillioides（F.verticillioides）序列的同源性達到89.72%以上；菌株22號與登陸號為JX045841.1的Fusarium proliferatum（F.proliferatum）序列的同源性為90.74%。接種試驗表明，4種鐮刀菌均能侵染活體煙苗并產(chǎn)生典型癥狀。因此，河南煙田危害煙草的鐮刀菌鑒定為F.oxysporum，F(xiàn).solani，F(xiàn).verticillioides及F. proliferatum。其中，F(xiàn).proliferatum侵染煙草在河南為首次報道。

煙草；鐮刀菌；形態(tài)鑒定；分子鑒定；致病性

鐮刀菌（Fusarium spp.）侵染煙草會引起枯萎病與根腐病。目前在我國云南［1］、湖南［2］、貴州［1，3］、福建［4］、湖北［5］、安徽［6］、山東［7］等省均有發(fā)生。桑維鈞等［3］首次報道了貴州省煙草鐮刀菌根腐病的主要病原為茄病鐮刀菌，但試驗未對病原菌進行分子鑒定；陳志敏［4］發(fā)現(xiàn)福建煙草鐮刀菌根腐病病原為尖孢鐮刀菌［F.oxysporum（Schlecht）Wr．var．nicotianae Johnson］、茄病鐮刀菌［F.solani（Mart.）Sacc.］、半裸鐮刀菌［F.semitectum Berk］，其中尖孢鐮刀菌致病性最強，是引起田間根腐病的優(yōu)勢病原種群；陳高航［5］證實了引起湖北恩施州煙草根腐病的致病菌是尖孢鐮刀菌；趙杰［7］提出山東省煙草鐮刀菌根腐病病原菌為茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌和厚垣鐮刀菌（F.chlamydosporium Wollenw.et Reinking），其中茄病鐮刀菌為優(yōu)勢病原菌。2011—2012年調(diào)查發(fā)現(xiàn)河南煙田枯萎病與根腐病病株率一般為5%～10%，嚴重的達30%以上，而有關(guān)河南煙田侵染煙草的鐮刀菌種類及優(yōu)勢病原菌的分子鑒定未見詳細報道。為此，以河南省主要產(chǎn)煙縣（市）煙草根、莖部具典型癥狀的煙株為樣本，通過組織分離、形態(tài)學觀察結(jié)合rDNA-ITS序列分析對病原菌進行鑒定，旨在明確危害河南煙草的鐮刀菌種類，為生產(chǎn)中有效防治該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源

2011—2012年，選擇河南省鄧州市、襄城縣、嵩縣等15個主要產(chǎn)煙縣（市），每個縣（市）選擇不同區(qū)域、不同品種、不同田塊類型的烤煙煙田，在煙草團棵期、旺長期、采收期分別進行3次普查，普查總面積不少于當?shù)胤N植面積的1%。每次調(diào)查田塊數(shù)量不少于10塊，每塊面積不少于667 m2，每塊田采用對角線5點取樣法，選取5個點，每個點隨機調(diào)查50株，每塊田共調(diào)查250株，取3～5株具有典型癥狀的病株，截取莖基部與部分根系或發(fā)病部位，由河南科技大學植物免疫學實驗室進行相關(guān)病原菌的分離與鑒定。

1.1.2 試劑和儀器

Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液（10×PCR buffer）、dNTP混合物（dNTP Mixture）購于TaKaRa公司，通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司提供，BIOMETRA PCR儀（德國Biometra公司），BST-20M型凝膠成像系統(tǒng)（英國Uvitec公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離

“天曉，為什么？”鏡心羽衣扶起倒在石頭旁的壺天曉，驚恐不安地問道，“你明明可以躲開的……你是怕……所以……”

在樣品病健交界處，切取組織或髓部碟片置于PDA培養(yǎng)基平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～4 d待菌落形成后，挑取邊緣菌落純化［7］。依據(jù)純化后的菌落特征分類編號，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)學觀察

挑取培養(yǎng)菌絲制作臨時水玻片，在光學顯微鏡下觀察并記錄分生孢子的大小、形狀，厚垣孢子的有無等，依據(jù)Booth分類系統(tǒng)對鐮刀菌進行分類鑒定［8-10］。

1.2.3 分子生物學鑒定

刮取培養(yǎng)5～7 d的菌絲體50 mg，采用CTAB法［11-12］提取基因組DNA。利用通用引物ITS1和ITS4對所提取的DNA進行PCR擴增，反應在25 μL反應體系中進行。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸105 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物在4℃條件下保存。取5 μL擴增產(chǎn)物，與1 μL上樣緩沖液混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，DNA Marker為對照，在1×TAE電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR擴增產(chǎn)物大小，觀察到合適的條帶后，將所對應的原始擴增產(chǎn)物（未純化）40 μL由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序結(jié)果在GenBank上進行BLAST比對，并使用ClustalX（1.83）軟件對此序列進行校準后，利用MAGA5軟件［12-13］以距離法［14］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 室內(nèi)致病性測定

在4類菌株中選出具有代表性的菌株各1皿，用打孔器制取直徑5 mm的菌餅；選用溫室內(nèi)培育的10葉期健康盆栽小黃金1025煙苗，在煙苗根莖部用接種針針刺傷口；把制好的菌餅貼于傷口處，用脫脂棉蘸取無菌水包裹在接種處，每個菌株接種4株，以空白PDA培養(yǎng)基作對照。將接種后的煙苗置于25℃左右，12/12 h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)性狀與形態(tài)特征

試驗共獲得鐮刀菌菌株22個，這些菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落大多數(shù)為白色，且菌落上有黃、紅、黑、紫等色素產(chǎn)生，菌絲茂密，呈棉絮狀，菌落生長質(zhì)地均勻。

菌株1～11號在顯微鏡下觀察到兩種類型的分生孢子，一種呈卵形至橢圓形，（6～13）μm×（2.5～5）μm；另一種大型分生孢子紡錘形至鐮刀形，頂端鉤狀，基部有足細胞，（23～53）μm×（2.5～5.5）μm。符合尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）的形態(tài)特征［8-10］。

菌株12～18號在顯微鏡下觀察小型分生孢子卵形，（7～11）μm×（2～4）μm，大型分生孢子彎筒形至近鐮刀形，頂端鈍圓，略呈喙狀，3～5個分隔，（27.5～48）μm×（3～ 5）μm。符合茄類鐮刀菌（F.solani）的形態(tài)特征［8-10］。

菌株19～21號在顯微鏡下觀察小型分生孢子橢圓至卵形，串生，呈鏈狀排列，大多數(shù)單胞，偶有1個隔膜，無色。符合輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）的形態(tài)特征［8-10］。

菌株22號在顯微鏡下觀察小型分生孢子長卵形或梨形，無隔或有1個隔膜，（4～11）μm×（2～4.5）μm。大型分生孢子細長，近直型，頂孢較尖，足細胞較明顯，3～ 7個隔膜，以3～5個隔膜居多，6～7隔膜的較少，（25～ 72.5）μm×（2.8～5.8）μm，符合已報道的層出鐮刀菌（F. proliferatum）的形態(tài)特征［15］。

2.2 ITS序列分析

將這22個菌株的PCR產(chǎn)物進行序列測定后，整合共獲得3種不同的序列，其有效長度分別為1～11號菌株476 bp，12～18號菌株499 bp，19～22號菌株490 bp。

在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對，用DNAMAN分析軟件將22個DNA序列與16個GenBank已登錄的鐮刀菌序列進行同源性比對。結(jié)果表明，1～11號菌株序列與數(shù)據(jù)庫中登錄號為KC429789.1等的F.oxysporum序列同源性為95.77%以上，結(jié)合形態(tài)學特征將這11個菌株鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）；12～18號菌株序列與數(shù)據(jù)庫中登錄號為JQ910159.1的F.solani序列同源性達到88.01%以上，結(jié)合形態(tài)學特征將這7個菌株鑒定為茄病鐮刀菌（F.solani）；19～21菌株序列與登錄號為HQ176444.1等的F.verticillioides序列同源性達到89.72%以上，結(jié)合形態(tài)學特征將這3個菌株鑒定為輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）；對22號菌株進行rDNA-ITS序列測定，獲得有效序列長度為499 bp，在GenBank上進行BLAST比對,與登錄號為JX045841.1等的F.proliferatum序列同源性達到90.74%以上，表明22號菌株為層出鐮刀菌（F.proliferatum）。

系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果（圖1）表明，1～11號菌株序列與F.oxysporum親緣關(guān)系最近；12～18號菌株序列與F.solani的親緣關(guān)系最近；19～22號菌株序列與F.verticillioides和F.proliferatum親緣關(guān)系最近，但串珠鐮刀菌是一個復合種［16］，而輪枝鐮刀菌F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg和層出鐮刀菌F.proliferatum是其復合種下所包含的兩個種，所以在系統(tǒng)發(fā)育樹中處于同一分支上。

圖1 鑒定菌株與GenBank上相關(guān)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1Phylogenetic tree of identify strains and correlation sequences

依據(jù)形態(tài)特征，結(jié)合rDNA-ITS序列分析，將河南煙田危害煙草的鐮刀菌鑒定為尖孢鐮刀菌F.oxysporum（Schlecht）Wr.、茄病鐮刀菌F.solani（Mart.）Sacc.、輪枝鐮刀菌F.verticillioides（Sacc.）Nirenberg及層出鐮刀菌F.proliferatum（Matsushima）Nirenberg。

2.3 致病性

接種病原菌4 d后，接種部位變褐色，病斑上下擴展；8 d后褐色部位加深，下部兩片葉變黃；11 d后病基部呈軟腐狀，略縊縮，根系出現(xiàn)大小不等的黃褐色病斑。取病莖與病根進行組織分離，可重新獲得病原菌，而對照植株無癥狀，證明這4種鐮刀菌均能對煙苗致病，并表現(xiàn)出了根腐病的癥狀。

3 小結(jié)與討論

依據(jù)形態(tài)特征，結(jié)合rDNA-ITS序列分析及致病性測定結(jié)果，將河南煙田危害煙草的鐮刀菌鑒定為尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）、茄病鐮刀菌（F.solani）、輪枝鐮刀菌（F.verticillioides）及層出鐮刀菌（F.proliferatum），其中F.proliferatum侵染煙草在河南為首次報道，而尖孢鐮刀菌分離頻率達50.0%，茄病鐮刀菌分離頻率為31.8%，為河南省引起煙草枯萎病與根腐病的主要致病菌。這與桑維鈞等［3］報道的貴州省煙草鐮刀菌根腐病的主要病原菌為茄病鐮刀菌，陳高航［5］報道的引起湖北恩施州煙草根腐病的致病菌是尖孢鐮刀菌的結(jié)果相符。

本試驗在形態(tài)學研究的基礎(chǔ)上，對經(jīng)過分子測序的幾種鐮刀菌的核糖體基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）進行BLAST比對，1～11號菌株鑒定為尖孢鐮刀菌，12～18號菌株鑒定為茄病鐮刀菌，19～21號菌株鑒定為輪枝鐮刀菌，22號菌株鑒定為層出鐮刀菌。而系統(tǒng)發(fā)育樹的結(jié)果表明，該方法對于區(qū)分尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌是切實可行的，而對于區(qū)分輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌則較困難。原因可能是過去將小型分生孢子串生、呈念珠狀排列的一類鐮刀菌歸為串珠鐮刀菌（F. moniliforme），而據(jù)報道至少有8個交配群曾在串珠鐮刀菌種名下或是其變種，其中輪枝鐮刀菌和層出鐮刀菌分別是A交配群和D交配群下的兩個種［17-20］，有著非常近的親緣關(guān)系，所以rDNA-ITS序列無法將兩者截然分開，有待使用ALFPF方法和EF-lalfa基因［15］等方法做進一步驗證。

在供試的病樣中分離出層出鐮刀菌，經(jīng)致病性測定能夠侵染煙草，這一結(jié)果與李冰［6］的試驗結(jié)果一致。該菌還能引起水稻穗腐?。?1］、玉米鞘腐?。?2］和穗腐?。?5］、大豆根腐?。?3］、地黃根腐?。?4］等，但對煙草致病性的強、弱仍有待進一步試驗。

在鐮刀菌對煙草的致病性試驗中，由于受季節(jié)的限制，選擇了10葉期健康的盆栽小黃金1025煙苗，在煙草抗黑脛病鑒定試驗中該品種為感煙草黑脛病菌〔Phytophthora parasitica var.nicotianae（Breda de Hean）Tuke〕的鑒別寄主。而有關(guān)鐮刀菌對目前生產(chǎn)中主栽煙草品種大田成株期的致病性尚有待進一步研究。

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Preliminary Molecular Identification of Fusarium Infecting Tobacco in Henan

TIAN Yanyan1,WANG Weijie2,MIAO Pu1,LI Shujun3,and KANG Yebin*1
1.College of Forestry,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,Henan,China
2.Songxian Branch of Luoyang Tobacco Company,Songxian 471400,Henan,China
3.Tobacco Research Institute of Henan Provincial Tobacco Company,Xuchang 461000,Henan,China

In order to identify the variety of Fusarium causing tobacco diseases in field,the typical infected tobacco plants were sampled from main tobacco growing areas in Henan,pure strains were isolated by tissue separation and identified by morphological method,pathogenicity test,and rDNA-ITS sequences analysis.The results of morphological observation showed that on PDA medium,all of the 22 isolated strains produced dense, gossypine hyphae with yellow,red or purple pigments;macroconidium was oval or sickle in shape,colorless, and multi-cell;microconidium was ovoid to oval in shape,colorless,single-cell or double-cell.BLAST analysis indicated that in GenBank sequence database,the homology of rDNA-ITS sequence was>95.77%between strains No.1-No.11 and Fusarium oxysporum(F.oxysporum,GenBank Accession No.KC429789.1),which was >88.01%between strains No.12-No.18 and Fusarium solani(F.solani,GenBank Accession No.JQ910159.1), >89.72%between strains No.19-No.21 and Fusarium verticillioides(F.verticillioides,GenBank Accession No. HQ176444.1),and>90.74%between strain No.22 and Fusarium proliferatum(F.proliferatum,GenBankAccession No.JX045841.1).Inoculation tests showed that all the mentioned Fusarium could infect living tobacco seedlings and generate typical symptoms.Consequently,the Fusarium infecting tobacco in Henan was identified as F.oxysporum,F.solani,F.verticillioides and F.proliferatum.F.proliferatum infection in Henan tobacco has not been reported before.

Tobacco;Fusarium;Morphological identification;Molecular identification;Pathogenicity

S432.41

A

1002-0861（2014）11-0089-04

中國煙草總公司科技項目“全國煙草有害生物調(diào)查研究”（110200902065）；河南省煙草公司科技項目“河南省煙草有害生物調(diào)查研究”（2012M10）。

田艷艷（1987—），在讀碩士研究生，研究方向：植物免疫學。E-mail：15138751943@163.com；*

康業(yè)斌E-mail：kangyb999@163.com

2014-05-30

責任編輯：董志堅E-mail：dzj@tobaccoinfo.com.cn電話：0371-67672650