大白菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)高效體系的研究

李 菲 張淑江 章時蕃 張 慧 孫日飛* 張振賢

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)（isolated microspore culture，IMC）是近年來興起的單倍體培養(yǎng)方法，具有單細(xì)胞、單倍體和較高胚胎發(fā)生率等優(yōu)點，可以迅速獲得大量純合的雙單倍體植株，為植物育種和基礎(chǔ)研究創(chuàng)造了廣闊的應(yīng)用前景。Lichter （1982）首次報道甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)成功獲得了小孢子胚狀體及其再生植株，推動了十字花科蕓薹屬蔬菜作物小孢子培養(yǎng)的興起，蕓薹屬作物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)得到了快速發(fā)展（付穎 等，2011；Ferrie & Caswell，2011；顧祥昆 等，2013）。

大白菜〔Brassica campestrisL.ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕是原產(chǎn)于我國的重要蔬菜作物，在我國蕓薹屬蔬菜中種植面積最大、種類最多，在生產(chǎn)中占據(jù)十分重要的經(jīng)濟(jì)地位，圍繞大白菜育種與研究開展的小孢子培養(yǎng)受到了極大重視。近年來，國內(nèi)外學(xué)者針對影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)效率的諸多因素進(jìn)行了廣泛的研究，明確了小孢子的發(fā)育時期、前期預(yù)處理以及供體植株的生長條件、培養(yǎng)基成分等因素均會影響大白菜小孢子培養(yǎng)的胚胎發(fā)生率（張鳳蘭 等，1994；劉凡 等，2001）。目前，通過技術(shù)改良，已建立起較為成熟的大白菜小孢子培養(yǎng)體系（李菲 等，2009），成為蕓薹屬蔬菜游離小孢子培養(yǎng)研究的主要作物之一。

大量研究顯示，基因型是決定小孢子胚胎發(fā)生能力的主要因素（Ajisaka et al.，1999；Zhang et al.，2003），但與之相關(guān)的功能基因的研究還未見新進(jìn)展。目前，集中進(jìn)行大群體材料小孢子培養(yǎng)難度較大，缺乏高效、穩(wěn)定的培養(yǎng)體系?，F(xiàn)有的培養(yǎng)體系在小孢子提取環(huán)節(jié)主要依靠手工擠壓，小孢子胚胎誘導(dǎo)效果受人為因素干擾較大，工作效率低，是開展群體材料小孢子培養(yǎng)研究的主要障礙。因此，提高小孢子培養(yǎng)的機械化操作、降低人為干擾、建立高效培養(yǎng)體系，是推動游離小孢子培養(yǎng)研究深入開展的前提。本試驗嘗試將機械化操作引入大白菜游離小孢子培養(yǎng)體系，利用細(xì)胞破碎儀提取小孢子，研究其對小孢子胚胎誘導(dǎo)效果的影響，以期建立高效的大白菜規(guī)模化小孢子培養(yǎng)體系，為集中開展大群體小孢子培養(yǎng)、進(jìn)一步探討小孢子胚胎發(fā)生的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜課題組選育的大白菜品種吉紅82 及#534DH 群體材料和#438 群體材料。2012年12月26日催芽播種于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所育苗室，進(jìn)行低溫春化處理，2013年3月6日定植于日光溫 室，常規(guī)栽培管理直至抽薹開花。

1.2 游離小孢子的機械化提取

以吉紅82為試材，選取長2～3 mm、小孢子主要處于單核靠邊期的花蕾，先用75%酒精浸泡30 s，7%次氯酸鈉溶液洗滌15 min，無菌蒸餾水沖洗3 遍；然后加入B5 改良提取液，進(jìn)行小孢子提?。ɡ罘?等，2009）。

采用細(xì)胞破碎儀（TOMY MS-100R）進(jìn)行小孢子的機械化提取。取50個適期花蕾于5 mL 離心管內(nèi)，添加B5 改良提取液至5 mL，以直徑0.8 cm 的鋼珠破碎花蕾。設(shè)計破碎轉(zhuǎn)速分別為2 000、2 500、3 000、4 200 r·min-1，破碎時間均為10 s；以人工研磨擠壓提取小孢子為對照?；ɡ倨扑楹?，用30 μm 無菌微孔紗布過濾至10 mL 離心管內(nèi)，洗滌離心3次，每次1 000 r·min-1離心5 min，以去除體細(xì)胞雜質(zhì)，收集提取小孢子。

1.3 游離小孢子活力的快速檢測

取1 滴大白菜小孢子懸浮液，加入1～2 滴醋酸洋紅溶液染色制片，用顯微鏡進(jìn)行觀察。小孢子呈現(xiàn)深紅色表明有生活力，淡紅色為無生活力，無色為死亡小孢子（劉絢霞，1998）。每份樣品隨機觀察4個視野，計算小孢子的平均活力。

1.4 游離小孢子培養(yǎng)濃度的快速確定

以#534DH 群體和#438 群體為試材，每份材料分3 組，每組收集40個適期花蕾于5 mL 離心管內(nèi)，采用細(xì)胞破碎儀機械提取小孢子，經(jīng)過濾、B5改良提取液洗滌，1 500 r·min-1、4 min 離心3次后，分別懸浮于20、25、30 mL NLN-13（蔗糖濃度為13%）培養(yǎng)基，采用血球記數(shù)板觀察計算小孢子懸浮液濃度。每份樣品觀察3個視野，計算平均濃度；比較相同花蕾數(shù)提取的小孢子懸浮于不同體積培養(yǎng)基的小孢子濃度，從而獲得快速確定小孢子培養(yǎng)濃度的方法。

1.5 小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的效果比較

以吉紅82 為試材，比較人工擠壓提取小孢子和采用細(xì)胞破碎儀機械提取小孢子培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo)效果。以#534DH 群體和#438 群體為試材，評價機械提取小孢子培養(yǎng)的胚胎誘導(dǎo)效果。

采用NLN-13 培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)分離提取后的小孢子（Sato et al.，1989），小孢子濃度為1×105～3×105個·mL-1，分裝于60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，每皿3 mL，Parafilm 封口后33℃熱激誘導(dǎo)24 h，轉(zhuǎn)入25℃暗培養(yǎng)，直至形成不定胚。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對大白菜小孢子提取效率的影響

由圖1可見，細(xì)胞破碎儀在轉(zhuǎn)速2 000 r·min-1和2 500 r·min-1條件下破碎10 s，均無法有效破碎花蕾；在轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1和4 200 r·min-1條件下破碎10 s，破碎效果良好，達(dá)到了人工擠壓破碎的程度（圖2）。相對于人工擠壓提取小孢子，利用細(xì)胞破碎儀可同時破碎多份材料（圖3），且10 s即可達(dá)到良好的破碎效果，而人工擠壓提取1 份材料一般需要3～5 min。

醋酸洋紅檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞破碎儀在轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1和4 200 r·min-1條件下破碎10 s 提取的小孢子活力與人工擠壓提取的小孢子活力差異不顯著（表1）；且相同花蕾數(shù)提取的小孢子經(jīng)3次洗滌離心后的提取量與人工擠壓的提取量也基本相同 （圖4）。

圖1 不同轉(zhuǎn)速處理破碎大白菜花蕾效果

圖2 機械破碎與人工擠壓提取大白菜小孢子的效果比較

圖3 機械破碎同時提取多份材料的小孢子

圖4 機械破碎的大白菜小孢子提取量與人工擠壓的提取量比較

表1 不同提取方法對大白菜吉紅82 小孢子活力的影響

2.2 游離小孢子培養(yǎng)濃度的快速確定

從表2可以看出，定容于25 mL或30 mL NLN-13 培養(yǎng)基的大白菜小孢子懸浮液濃度大多數(shù)在1×105～3×105個·mL-1之間，符合小孢子培養(yǎng)的濃度要求；而定容于20 mL NLN-13 培養(yǎng)基的大白菜小孢子懸浮液濃度多數(shù)偏高，平均濃度與定容于25 mL 或30 mL NLN-13 培養(yǎng)基的大白菜小孢子懸浮液平均濃度差異達(dá)極顯著水平?？紤]試驗中在洗滌離心環(huán)節(jié)存在的操作誤差，認(rèn)為5 mL 離心管收集40個適期花蕾、利用細(xì)胞破碎儀提取小孢子定容于25 mL NLN-13 培養(yǎng)基更能穩(wěn)定滿足小孢子培養(yǎng)濃度的要求。

從表2還可以看出，#534DH 群體和#438 群體各材料間小孢子懸浮液濃度差異不顯著，說明大白菜小孢子提取機械化操作是可行的。

2.3 小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的效果

肉眼觀察結(jié)果顯示（圖5），兩種方式提取的小孢子均能成功誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，胚狀體數(shù)量沒有明顯差異，說明細(xì)胞破碎儀可以取代人工擠壓用于大白菜游離小孢子培養(yǎng)的小孢子收集提取。

由圖6可見，不同材料單株提取的小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生存在極顯著差異，有的材料未能誘導(dǎo)胚狀體生成，如534-1、534-18；有的材料有少量胚狀體生成，如534-2、438-66、438-96 等；也有大量出胚的材料，如534-38、438-42（表3）。說明利用細(xì)胞破碎儀提取的小孢子進(jìn)行胚胎誘導(dǎo)，能夠客觀反映出不同材料間小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生能力的 差異。

表2 不同NLN-13 培養(yǎng)基定容體積對大白菜小孢子懸浮液濃度的影響

圖5 機械破碎提取與人工擠壓提取的小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的效果

3 結(jié)論與討論

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)由于其在胚胎發(fā)育學(xué)研究、基礎(chǔ)研究的群體構(gòu)建以及育種工作中潛在的應(yīng)用價值，一直受到廣泛關(guān)注，但小孢子培養(yǎng)屬于組培范疇的細(xì)胞培養(yǎng)，大量的外界干擾因素影響了這一技術(shù)的高效應(yīng)用。蕓薹屬作物小孢子培養(yǎng)相對于其他作物較為成功，特別是甘藍(lán)型油菜、大白菜、甘藍(lán)等作物都已建立較為成熟的培養(yǎng)體系（Shashi et al.，2004）。在供體植株的培養(yǎng)條件上，通過人工氣候室栽培創(chuàng)造了較為恒定的栽培條件；精細(xì)量化培養(yǎng)基成分，減少了誘導(dǎo)環(huán)節(jié)的操作誤差。但人為干擾因素仍然在很大程度上影響了小孢子培養(yǎng)的可重復(fù)性，相同材料在不同人員操作下，如花蕾擠壓提取時的擠壓力度不同、試驗操作的細(xì)節(jié)差異等都有可能影響后期小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的效果。同時，目前的游離小孢子培養(yǎng)仍局限于小規(guī)模的試驗操作，能夠進(jìn)行大量材料的高效誘導(dǎo)培養(yǎng)是這一技術(shù)廣泛應(yīng)用的前提。

圖6 機械提取大白菜小孢子胚胎發(fā)生情況

表3 不同材料機械提取小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生情況

本試驗嘗試用機械提取小孢子替代人工擠壓提取，結(jié)果顯示細(xì)胞破碎儀可以很好的替代人工操作，小孢子的提取量及小孢子活力與人工擠壓提取無顯著差異。一般利用5 mL 離心管收集40～50個適期花蕾，10 s 即可同時均勻破碎6 份材料，提取效率大大超過人工提取。如更換小離心管進(jìn)行少量小孢子的收集，則可同時進(jìn)行更多材料的提取。

小孢子培養(yǎng)是單細(xì)胞的群體培養(yǎng)，小孢子濃度對胚胎誘導(dǎo)率有一定的影響（申娟 等，2008），但目前要達(dá)到小孢子準(zhǔn)確的定量培養(yǎng)還有一定難度。現(xiàn)有培養(yǎng)體系，人工擠壓提取小孢子，相同花蕾數(shù)由于操作中擠壓力度不同，小孢子的提取量存在差異，對小孢子的濃度調(diào)整一般采用血球計數(shù)板計算調(diào)整；本試驗通過20 份材料的3 組小孢子濃度比較認(rèn)為，利用細(xì)胞破碎儀（TOMY MS-100R）進(jìn)行小孢子的機械化提取，用力均勻，小孢子提取量較為穩(wěn)定，從試驗操作上簡化了濃度調(diào)整環(huán)節(jié)，提高了工作效率。

觀察機械提取小孢子誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的情況，結(jié)果顯示機械提取小孢子經(jīng)懸浮培養(yǎng)可正常誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，可以客觀反映材料單株的小孢子胚胎發(fā)生能力。值得注意的是，本試驗發(fā)現(xiàn)在適宜的小孢子培養(yǎng)濃度范圍內(nèi)，小孢子的濃度不是影響胚胎發(fā)生的主要因素。如參試材料534-14 的小孢子濃度為90 000個·mL-1，每皿的平均出胚量為14.75個，與534-3 的每皿平均出胚量17.25個無顯著差異，而534-3 的小孢子濃度為200 000個·mL-1；534-38 的 小 孢 子 濃 度 為160 000個·mL-1，與534-3的小孢子濃度較為接近，但534-38 的每皿平均出胚量為108.75個，與534-3 的每皿平均出胚量17.25個達(dá)到極顯著差異。同樣，參試材料438-7與438-42 的小孢子濃度分別為70 000個·mL-1和100 000個·mL-1，每皿平均出胚量分別為79.50個和119.75個，都極顯著高于小孢子濃度為190 000個·mL-1、每皿平均出胚量為2.25個的438-66。由此可見，大白菜小孢子濃度雖影響小孢子的胚胎誘導(dǎo)率，但小孢子的胚胎發(fā)生能力主要取決于材料本身特性。

本試驗為建立高效的大白菜游離小孢子培養(yǎng)體系，在國內(nèi)首次嘗試了用機械提取小孢子替代人工擠壓方法，在一定程度上消除了人為干擾對試驗結(jié)果的影響。在簡化試驗操作、提高試驗效率上都有令人滿意的結(jié)果，這為集中開展大批量試驗材料的游離小孢子培養(yǎng)，進(jìn)行更為深入細(xì)致的群體研究提供了更優(yōu)化的試驗平臺。本試驗結(jié)果對大白菜小孢子培養(yǎng)體系是個新的突破，小孢子培養(yǎng)的完全機械化操作是未來發(fā)展的趨勢。

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