新疆特色維藥瘤果黑種草籽的抗氧化活性研究

于明，劉玲玲，徐鑫，吳新風(fēng)

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所加工研究室，新疆烏魯木齊830091）

新疆特色維藥瘤果黑種草籽的抗氧化活性研究

于明，劉玲玲，徐鑫，吳新風(fēng)

（新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所加工研究室，新疆烏魯木齊830091）

以不同極性溶劑分別對瘤果黑種草籽進(jìn)行提取，得到甲醇提取物、乙酸乙酯提取物、正己烷提取物，并采用二苯代苦味?；杂苫―PPH），2,2'-連氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）和還原能力三種不同的實驗方法評價新疆瘤果黑種草籽抗氧化活性。結(jié)果表明，瘤果黑種草籽提取物具有不同程度的抗氧化能力，甲醇提取物的抗氧化活性相對優(yōu)于其它溶劑萃取物，清除DPPH自由基的能力優(yōu)于BHT，瘤果黑種草籽各溶劑提取物具有較強(qiáng)ABTS清除能力，最高清除率達(dá)81.33%，其ABTS自由基清除率強(qiáng)弱順序為甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物；黑種草籽提取物還原能力強(qiáng)弱順序為甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物。瘤果黑種草籽提取物具有很好的抗氧化活性，不同溶劑提取物對抗氧化活性有很大影響。

瘤果黑種草籽；溶劑萃取；抗氧化活性

黑種草屬毛茛科（Ranuncualceac）金蓮花亞科黑種草屬（Nigella）植物，目前作為藥用的有3種，分別是瘤果黑種草（Nigella glanduliferaFreyn），又名腺毛黑種草；果黑種草（Nigella sativa），又名家黑種草以及黑種草（Nigella damascene）[1]。瘤果黑種草主產(chǎn)地新疆，是新疆特有的植物資源，為我國新疆維吾爾族常用藥材[2]。藥用部位一般為種子，維吾爾族名為斯亞旦，瘤果黑種草籽已作為維藥材收入《中華人民共和國藥典》和《中國民族藥志》[3]。在維吾爾醫(yī)藥中，黑種草具有利尿、補(bǔ)腦、補(bǔ)腎、活血、解毒、下乳、通經(jīng)、止咳、烏發(fā)、抗衰老等作用[4]，研究表明其具有抗菌，抗腫瘤的功效，近年來研究發(fā)現(xiàn)瘤果黑種草籽可以預(yù)防支氣管疾病，加強(qiáng)免疫力，降血壓和鎮(zhèn)痙劑（止痙攣）等[5-8]。另外，瘤果黑種籽草富含多種有效成分，具有獨特的芳香味并含有豐富的脂肪酸和揮發(fā)性精油，維吾爾族群眾常用瘤果黑種草種籽作為焙烤面點的調(diào)味品[9]。目前國內(nèi)外對于瘤果黑種草籽的化學(xué)成分和藥理作用研究較多，而對于其抗氧化能力的評價相對較少[10-11]。本研究采用三種不同抗氧化實驗對瘤果黑種草籽溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行評價，旨在為瘤果黑種草籽的藥用機(jī)理研究以及今后天然抗氧化劑的開發(fā)合成及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，從而為更好的開發(fā)利用新疆特有藥食兩用植物資源提供堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瘤果黑種草籽：新疆維吾爾民族醫(yī)藥市場；2,6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、抗壞血酸（vitaminC，VC）：上海源葉生物科技有限公司；乙醇、過硫酸鉀、鐵氰化鉀：天津市登科化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。二苯代苦味?；杂苫?,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）；2,2’連氨-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）：美國阿拉丁試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004N型電子天平：上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；DZTW型調(diào)溫電熱套、SHB-ⅢS循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FW80粉碎機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；RE-5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；JOYN-SXT-06索氏提取器、HH-S1恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；L6S紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；LD4-2離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 瘤果黑種草籽溶劑萃取物的制備

采用三種不同極性的有機(jī)溶劑甲醇、乙酸乙酯、正己烷進(jìn)行索氏提取，分別稱取25 g瘤果黑種草籽粉末于500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL不同極性的有機(jī)溶劑后加熱回流提取4 h，反復(fù)3～5次，合并回收有機(jī)溶劑，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取物，制得浸膏，備用。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)方法[12]，用無水乙醇配制成0.02 mmol/L的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，將樣品用乙醇配制成一系列質(zhì)量濃度（0.2～1.0 mg/mL），取2.0 mL樣品于試管中，并加入2.0 mL DPPH乙醇溶液，用2 mL乙醇作為空白對照組代替樣品，25℃水浴加熱30 min后，在波長515 nm處測定吸光度值。以BHT和VC作為參照品，每組實驗平行測三次，取平均值。DPPH自由基清除率計算公式：

DPPH自由基清除率=[（AControl-ASample）/AControl]×100%

式中：AControl為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL乙醇混合后的吸光度值；ASample為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL樣品混合后的吸光度值。

1.3.3 ABTS自由基清除能力的測定

參照文獻(xiàn)[13]將ABTS用去離子水配制成7 mmol/L的自由基準(zhǔn)備液，然后往準(zhǔn)備液中加入過硫酸鉀固體，使此準(zhǔn)備液的過硫酸鉀濃度變?yōu)?.45 mmol/L，室溫避光保存12～16 h。實驗時用無水乙醇將ABTS儲備液在734 nm處稀釋到吸光度值在0.7±0.02區(qū)間內(nèi)。取0.15 mL質(zhì)量濃度在0.125～2.000 mg/mL的樣品于試管中，加入2.85 mL ABTS自由基工作液，充分混勻，放置10 min后，在734 nm處測定吸光度值。以BHT和VC作為參照品，每份樣品平行操作三次。ABTS自由基清除率計算公式：

ABTS自由基清除率=[（AControl-ASample）/AControl]×100%

式中：AControl為0.15 mL ABTS溶液與2.85 mL無水乙醇混合后的吸光度值；ASample為0.15 mL樣品與2.85 mL ABTS溶液混合后的吸光度值。

1.3.4 還原能力的測定

參照文獻(xiàn)方法[14]，其原理為樣品能將Fe3+還原為Fe2+來評價其還原能力。取不同濃度樣品溶液2.5 mL，分別加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（0.2 mol/mL，pH=6.8），2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀（K3[Fe（CN）6]），在50℃水浴恒溫反應(yīng)20 min后快速冷卻，加入三氯乙酸溶液2.5 mL搖勻，于4 000 r/min離心10 min，取出上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%FeCl3溶液0.5 mL，混勻后靜置10 min，在波長700 nm下測定吸光度值。以蒸餾水作為參比溶液，同時用BHT和VC作對比實驗，每組實驗重復(fù)三次，取平均值。吸光值越大，則樣品的還原能力越大。還原能力計算公式：

還原能力=ASample-AControl

式中：ASample為樣品的吸光度值，AControl為空白液的吸光度值。

1.3.5 半數(shù)抑制率的計算

半數(shù)抑制率（50%inhibitive concentration，IC50）指清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度，根據(jù)不同濃度抗氧化劑的清除率作曲線求出。IC50越小，抗氧化活性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力的測定

不同溶劑提取物DPPH自由基清除率（Y）與各溶劑提取物質(zhì)量濃度（X）的關(guān)系見表1，不同溶劑提取物對DPPH自由基清除率見圖1。

表1 不同溶劑萃取物質(zhì)量濃度與DPPH自由基的清除率的關(guān)系Table 1 Relationship between different solvent extracts concentration and DPPH scavenging capacity

圖1 不同溶劑提取物對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different solvent extracts on DPPH radical scavenging capacity

由表1及圖1可知，按照IC50值，瘤果黑種草籽不同溶劑萃取物與BHT、VC對DPPH自由基的清除能力由強(qiáng)到弱依次為VC＞甲醇提取物＞BHT＞乙酸乙酯提取物＞正己烷提取物。瘤果黑種草籽提取物中極性溶劑甲醇的清除自由基的活性最強(qiáng)，且甲醇提取物的清除活性大于對照品BHT的清除活性，但低于VC的清除活性。結(jié)果表明，提取物的質(zhì)量濃度越大，DPPH自由基的清除率越高。

2.2 ABTS自由基清除能力的測定

不同溶劑萃取物對ABTS自由基的清除作用結(jié)果見圖2。由圖2可知，不同溶劑萃取物隨質(zhì)量濃度的增加對ABTS自由基的清除作用增強(qiáng)。不同溶劑萃取物對ABTS自由基的清除能力由強(qiáng)到弱為VC＞BHT＞甲醇提取物＞乙酸乙酯提取物＞正已烷提取物。當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)到2 mg/mL時，3種溶劑提取物的ABTS自由基清除率分別為81.33%、38.16%、33.89%，甲醇提取物表現(xiàn)出了很強(qiáng)的ABTS自由基清除率，但是低于對照VC及BHT。

圖2 不同溶劑提取物對ABTS自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different solvent extracts on ABTS radical scavenging capacity

2.3 還原能力的測定

不同提取物還原能力測定結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著瘤果黑種草籽提取物質(zhì)量濃度的增加，還原力剛開始迅速增加，隨后增長趨于平緩。還原能力是其抗氧化活性的重要指標(biāo)，一般物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)，其抗氧化活性也越強(qiáng)[15]。由圖3可知，不同提取物的還原能力均與其質(zhì)量濃度呈現(xiàn)出正相關(guān)性，即質(zhì)量濃度越大，還原能力越強(qiáng)。不同提取物還原能力由強(qiáng)到弱依次為VC＞BHT＞甲醇提取物＞正己烷提取物＞乙酸乙酯提取物。

圖3 不同溶劑提取物對還原能力的影響Fig.3 Effect of different solvent extracts on reducing capacity

3 結(jié)論

通過新疆瘤果黑種草籽不同溶劑提取物的三種抗氧化能力的試驗，并與人工合成的抗氧化劑BHT和VC進(jìn)行相比較得出，3種提取物均具有一定的的清除DPPH自由基的能力，其中甲醇提取物的清除活性高于BHT，但是低于對照VC。對ABTS自由基的清除活性也表明，甲醇提取物的清除率最高達(dá)到81.33%，但是低于對照VC及BHT。甲醇提取物在還原能力實驗中甲醇提取物也表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。

不同溶劑提取物抗氧化能力不同，這可能是由于不同溶劑極性強(qiáng)弱不同，所萃取的萃取物成分不同，其所含抗氧化物質(zhì)的總量和結(jié)構(gòu)也不同，故在不同的抗氧化體系中，其抗氧化作用也不同。結(jié)果表明，新疆瘤果黑種草籽提取物具有一定的的抗氧化活性，可以作為一種天然抗氧化劑進(jìn)行深層次開發(fā)利用。

[1]肖克來提·吐達(dá)洪，木哈巴提.維吾爾藥黑種草的國內(nèi)外應(yīng)用簡介[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2002，8（3）：28-29.

[2]劉勇民，沙吾提·依克木.維吾爾藥志[M].烏魯木齊：新疆人民出版社. 1986.

[3]潘蘭，賈曉光，李曉瑾，等.維藥瘤果黑種草子的化學(xué)成分初步分析（I）[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，46（4）：873-876.

[4]譚秀芳.新疆北疆引種黑種草籽化學(xué)成分的預(yù)試驗研究[J].新疆中醫(yī)藥，2012，30（6）：9-12.

[5]陳其賓.以降糖活性為導(dǎo)向的瘤果黑種草籽化學(xué)成分研究[J].2013，10（4）：99-103.

[6]范雪琦.黑種草籽調(diào)節(jié)黑素合成的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)[J].吉林大學(xué)學(xué)報：理學(xué)版，2011，49（4）：787-791.

[7]馮章英，周丹，劉艾林，等.常用中藥提取物對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶的抑制活性評價[C].中國藥理學(xué)會第十一次全國學(xué)術(shù)會議?？?011.

[8]信學(xué)雷.維藥-瘤果黑種草籽化學(xué)成分及降脂、降糖活性的研究[D].蘭州：中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所博士論文，2008.

[9]ALI K,GHAZALI H M,YASSORALIPOUR A.Physicochemical characteristics ofNigellaseed(Nigella sativaL.)oil as affected by different extraction methods[J].J Am Oil Chem Soc,2011,88(9):533-540.

[10]BURITS M,BUCAR F.Antioxidant activity ofNigella sativaessential oil[J].Phytother Res,2000,14(6):323-328.

[11]SALEM M L.Immunomodulatory and therapeutic properties of the Nigella sativaL.seed[J].Int Immunopharmacol,2005,5(6):1749-1770.

[12]劉博奧，劉繼國，劉偉.天山雪菊不同溶劑提取物的抗氧化活性研究[J].中國釀造，2014，33（3）：71-75.

[13]BRAND-WILLIAMS W,CUVELIER M E,BERSET C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].LWT-Food Sci Technol,1995,28(1):25-30.

[14]王強(qiáng)，劉玲玲，張正方.新疆產(chǎn)孜然抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，16（3）：138-141.

[15]呂娜，劉陽，夏海洋.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子抗氧化物質(zhì)工藝[J].中國釀造，2014，33（4）：52-55.

Antioxidant activity of Xinjiang Uighur medicineNigella sativaL.seeds

YU Ming,LIU Lingling,XU Xin,WU Xinfeng
(Research Institute of Cereal Crop,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China)

TheNigella sativaL.seeds were extracted by different polar solvent of methanol,ethyl acetate and hexane,and the antioxidant activities of the samples were evaluated by three different test systems,DPPH,ABTS and reducing capacity.Result showed thatN.sativaL.seeds extract showed different antioxidant activity,the antioxidant of methanol extract was significantly stronger than the others,and the scavenging DPPH radicals activity was superior to BHT.All extracts had stronger ABTS scavenging activities;the highest scavenging rate was up to 81.33%.The ABTS free radical scavenging activity and reducing capacity in order was methanol extract,ethyl acetate extract,hexane extract.The results suggested that the seeds extract exhibited strong antioxidant activity,and different polar solvent had strong effect on antioxidant activity.

Nigella sativaL.seeds;solvent extract;antioxidant activity

R29

A

0254-5071（2014）11-0110-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.025

2014-09-23

新疆科技興新項目（2012017B10）

于明（1973-），男，副研究員，碩士，主要從事新疆特色農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)研究。