鐵、鈣離子補料對杜氏鹽藻生長的影響

呂和鑫，賈士儒，崔相敢，夏鋒

（天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457）

鐵、鈣離子補料對杜氏鹽藻生長的影響

呂和鑫，賈士儒*，崔相敢，夏鋒

（天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457）

通過原子吸收光譜測定了杜氏鹽藻對鈣、鎂、鉀、鐵四種離子的消耗速率，構(gòu)建金屬離子含量限制型培養(yǎng)基，研究了補加金屬離子對杜氏鹽藻生長光合速率、色素含量的影響。結(jié)果表明，對數(shù)期杜氏鹽藻細胞對鐵離子與鈣離子的消耗呈線性降低，每增殖106個細胞分別消耗0.042 μg的鐵離子與0.708 μg的鈣離子，而在穩(wěn)定期后，鈣、鐵離子濃度繼續(xù)下降。生長時期中鉀離子與鎂離子的含量變化不顯著。鐵、鈣離子補料能恢復(fù)杜氏鹽藻的生長，但光合活性與色素含量變化較補料前的對數(shù)期光合速率與色素含量要低，但總類胡蘿卜素含量要高于補料前對數(shù)期的。培養(yǎng)到穩(wěn)定期的培養(yǎng)基經(jīng)過回收補加有限的鐵、鈣離子后，細胞生長延滯期消失，但穩(wěn)定期細胞濃度降低?；亓髋囵B(yǎng)基對數(shù)期細胞的光合速率與葉綠素含量降低，但是總類胡蘿卜素含量升高。

杜氏鹽藻；β-胡蘿卜素；金屬離子；消耗速率；基質(zhì)消耗動力學(xué)

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）是一種在脅迫生長條件下可大量產(chǎn)生具有抗氧化活性的β-胡蘿卜素（β-carotene）與黃體素（lutein）的單細胞海洋綠藻，其產(chǎn)生的β-胡蘿卜素被用作食品添加劑與著色劑、飼料添加劑、復(fù)合維生素制劑、化妝品中的抗氧化劑等[1]。杜氏鹽藻在生長環(huán)境適宜的條件下具有一對鞭毛，使細胞具有游動能力，但是在一些如營養(yǎng)缺乏、低溫、高光照、高鹽度等極端環(huán)境條件下，鹽藻細胞會發(fā)生一些如鞭毛脫落等形態(tài)與油脂積累、胡蘿卜素積累等生化方面的調(diào)整以便更好地適應(yīng)環(huán)境變化[1-2]。胡蘿卜素可以捕獲光能防止光合系統(tǒng)光氧化損傷的發(fā)生[3-5]，可以增強葉綠體膜在氧化脅迫狀態(tài)下的穩(wěn)定性[1，6]。杜氏鹽藻中胡蘿卜素主要積累于葉綠體中的內(nèi)囊體之間的油質(zhì)體（oil globules）中，使得細胞呈現(xiàn)橙色或紅色。有報道表明，杜氏鹽藻細胞中胡蘿卜素的積累量與一個細胞分裂周期中接收的光照多少成正比，胡蘿卜素的積累量受到高光照輻射、高鹽度、溫度脅迫以及營養(yǎng)脅迫的促進[2]。COESEL S N等[7]的實驗表明，杜氏鹽藻在營養(yǎng)充足時，單獨或同時施加高光照與高鹽度脅迫均不能誘導(dǎo)胡蘿卜素的積累。而在營養(yǎng)脅迫的培養(yǎng)條件下，單獨或同時施加高光照與高鹽度均能促進胡蘿卜素的積累，穩(wěn)定狀態(tài)的八氫番茄紅素合成酶（phytoene synthase）與八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase）的信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）的表達量也同時增高。所以，營養(yǎng)脅迫是杜氏鹽藻胡蘿卜素合成的前提條件，而高光照與高鹽度可以促進胡蘿卜素的積累速度與水平。

因此，研究鹽藻培養(yǎng)中各礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的動態(tài)消耗情況對于理解胡蘿卜素合成途徑與礦質(zhì)營養(yǎng)鹽在調(diào)控上的關(guān)系以及實現(xiàn)鹽藻大規(guī)模生產(chǎn)中控制胡蘿卜素合成的時間與含量具有較大的理論與應(yīng)用價值。金屬離子是細胞必需的營養(yǎng)成分，可作為酶的活性結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)成分、參與一些活性分子如色素的結(jié)構(gòu)維持、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的離子與滲透壓平衡等。本研究通過跟蹤鹽藻分批發(fā)酵培養(yǎng)中的對數(shù)期與穩(wěn)定期鉀鈣鎂鐵金屬離子的濃度，確定了鹽藻培養(yǎng)過程中鐵、鈣、鎂與鉀四種金屬離子的消耗速率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜氏鹽藻（Dunaliella salina）：天津科技大學(xué)天津市工業(yè)微生物重點實驗室保存。

采用改良的Johnsons培養(yǎng)基[8]：MgCl2·7H2O 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KNO30.5 g/L，KCl 0.2 g/L，NaHCO30.151 g/L，KH2PO40.043 g/L，CaCl20.035 g/L，NaCl 30.0 g/L，Na2EDTA·2H2O 2.09 mg/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 2.44 mg/L，H3BO30.61mg/L，（NH4）6Mo7O24·4H2O0.38mg/L，ZnCl20.041mg/L，CuSO4·5H2O 0.06 mg/L，CoCl2·6H2O 0.051 mg/L，MnCl2· 4H2O 0.041 mg/L。

其他試劑均為分析純：天津化學(xué)試劑三廠。

1.2 儀器與設(shè)備

島津AA-6800原子吸收光譜儀、島津UVmini-1240紫外可見分光光度計：日本島津有限公司；PHSJ-4A pH計：上海雷磁儀器廠；LD5-2A臺式高速離心機：上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

利用250 mL玻璃搖瓶，加入改良的Johnsons培養(yǎng)基[8]靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)體系均是150 mL。每天輕輕搖動若干次使藻液混勻。培養(yǎng)光照強度為60 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度保持為27℃。每次接種均為對數(shù)期細胞，接種光密度（OD430nm）為0.1，接種后給予兩個連續(xù)的光暗周期（12 h/12 h）以同步化細胞的生長時期，兩個光周期后采用連續(xù)光照培養(yǎng)。

鐵、鈣離子限制型培養(yǎng)基的配制：鐵離子為0.123 mg/L；鈣離子為2.07 mg/L；其他離子量同Johnsons培養(yǎng)基，細胞密度0.15×106CFU/mL。離心收集的藻細胞用新鮮鐵、鈣離子限制型培養(yǎng)基漂洗3次后接種，接種光密度（OD430nm）為0.1。

鐵、鈣回流培養(yǎng)基的配制：離心去除穩(wěn)定期藻細胞后的培養(yǎng)基利用0.22 μm濾膜過濾后，回流培養(yǎng)基的中的鐵、鈣離子的質(zhì)量濃度為35.31 μg/L與4.86 μg/mL，補加鐵離子質(zhì)量濃度至0.187 mg/L，其他離子量同Johnsons培養(yǎng)基。藻細胞用回流培養(yǎng)基漂洗3次后接種。接種光密度（OD430nm）為0.1，接種細胞密度為0.15×106CFU/mL。

2.印尼北干巴魯領(lǐng)隊連俊偉先生之感言：(我們)雖然回到家，心卻留在長沙，每天幾乎還緊盯冬令營的日程表，預(yù)備再整裝出發(fā)：去上課吟詩，去練習(xí)武術(shù)，去舞龍，去跳藏族的青春舞蹈，去品嘗湖南佳肴，去觀賞冬天奇景，去打雪仗……希望在中華文化彌漫的長沙天空再作一次深深的呼吸！看，我們都已陶醉在冬令營的激情里：望山，山還在招手；望湖，湖還在微笑；望你，你說這就是夢中宏偉的江山！望我，我口中的“鄉(xiāng)愁”不再是“一灣淺淺的海峽”，而是“千里迢迢的故鄉(xiāng)”。(長沙《湖南師范大學(xué)》特刊)

1.3.2 測定方法

普通光學(xué)顯微鏡下細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，記數(shù)前在1 mL鹽藻培養(yǎng)液中加入一滴魯格氏液進行細胞固定。

細胞光密度于波長430 nm處測定，空白對照選用改良的Johnsons培養(yǎng)基。

色素測定：4 000 r/min離心5 min收集藻細胞，體積分數(shù)為80%丙酮重懸細胞后避光，4℃過夜提取色素后于波長470 nm、645 nm、662 nm處測定吸光度值，然后計算總胡蘿卜素、葉綠素a與b的含量，計算公式如下[9-10]：

金屬離子的測定采用原子吸收光譜法：4 000 r/min離心去除細胞，0.22 μm濾膜過濾，取7 mL去掉細胞的發(fā)酵液利用10 mL硝酸+2 mL高氯酸加熱消化至溶液由黃變清體積大約2 mL后進行定容。金屬離子鈣（Ca）、鉀（K）、鎂（Mg）及鐵（Fe）測定條件見表1。

表1 原子吸收光譜采用的實驗條件Table 1 Experimental conditions of atomic absorption spectrum

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5進行數(shù)據(jù)分析與作圖；采用SPSS 19.0進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜氏鹽藻鈣、鎂、鉀、鐵離子的消耗速率

在本研究的實驗條件與接種密度下，杜氏鹽藻的生長曲線見圖1。由圖1可知，杜氏鹽藻生長的延滯期為3 d，在第4天進入對數(shù)生長期，在16 d后進入穩(wěn)定生長期。

選擇對數(shù)期的3個時間點（細胞密度為0.77× 106CFU/mL，1.84×106CFU/mL，2.12×106CFU/mL）與細胞密度不再繼續(xù)增加的穩(wěn)定期的兩個時間點（4.52×106CFU/mL），測定以上5個時間點培養(yǎng)基中鈣、鎂、鉀、鐵離子的濃度。實驗結(jié)果表明，隨著細胞密度的升高，鉀、鎂離子在不同細胞密度時差異不顯著（P＞0.05），因此表明這兩種離子的消耗速率近似為零。鈣、鐵離子在不同細胞密度的變化，結(jié)果見圖2。由圖2可知，鈣、鐵離子的消耗與細胞密度的增加呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，鐵離子與鈣離子在對數(shù)期前三個時間點的濃度值的線性擬合曲線的相關(guān)系數(shù)達0.999與0.895，擬合曲線分別為y=-42.46x+249.1與y=-0.708x+9.602。以增殖106個細胞消耗的離子量為計算單位，鐵離子在對數(shù)期中的消耗速率為0.042 μg/106個細胞，鈣離子在對數(shù)期中的消耗速率為0.708 μg/106個細胞。

圖2 發(fā)酵液中鐵離子(A)及鈣離子(B)濃度的變化Fig.2 Changes of iron ion(A)and calcium ions(B)concentration at different growth phases

2.2 鐵、鈣離子濃度限制型培養(yǎng)基補料培養(yǎng)

在接種光密度（OD430nm）為0.1時，鐵、鈣離子濃度限制型培養(yǎng)基中含有的鐵、鈣離子的量夠細胞長到細胞密度大約為3×106CFU/mL（OD430nm=2.0）。結(jié)果表明，最終細胞密度為3.88×106CFU/mL（OD430nm=2.47）。細胞進入穩(wěn)定期后，繼續(xù)補加細胞增加0.5×106CFU/mL細胞密度的鐵與鈣離子的量，結(jié)果表明細胞密度繼續(xù)增加至4.22×106CFU/mL后停止增加（OD430nm=2.8），對比鐵、鈣離子前后對數(shù)期的杜氏鹽藻細胞的光合速率、呼吸速率、光合色素含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，鐵、鈣離子限制型培養(yǎng)基中藻細胞的凈光合速率、葉綠素a、葉綠素b均顯著低于完全培養(yǎng)基對照，兩種培養(yǎng)基中的藻細胞的呼吸速率沒有顯著差異。鐵、鈣離子限制型培養(yǎng)基中藻細胞的總類胡蘿卜素含量要高于完全培養(yǎng)基對照。

表2 離子限制型培養(yǎng)基鐵、鈣補料前后杜氏鹽藻光合速率與色素含量Table 2 Comparisons of photosynthetic rates,pigments contents before and after ion feeding in ion type restrictions medium

2.3 培養(yǎng)基回流培養(yǎng)中鐵、鈣離子補料培養(yǎng)

鐵、鈣回流培養(yǎng)基中含有可供鹽藻細胞長到密度4.62×106CFU/mL（OD430nm=3.0）的鐵、鈣離子的量。取對數(shù)期細胞接種于鐵、鈣回流培養(yǎng)基中，可得藻細胞的生長曲線見圖3，與改良的Johnsons培養(yǎng)基中藻細胞相比，回流培養(yǎng)基中藻細胞沒有延滯期，而改良的Johnsons培養(yǎng)基中藻細胞第3天細胞密度開始升高。由圖3可知，回流培養(yǎng)基中的細胞在16 d到達穩(wěn)定期，而改良的Johnsons培養(yǎng)基在20 d到達穩(wěn)定期，細胞密度也大于回流培養(yǎng)基中的細胞。

圖3 回流培養(yǎng)基與Johnsons培養(yǎng)基中杜氏鹽藻的生長曲線Fig.3 Growth curves ofDunaliella salinain fed-batch media and Johnsons media

對比兩種培養(yǎng)基中藻細胞對數(shù)期的光合作用于與色素組成，結(jié)果見表3。由表3可知，回流培養(yǎng)基藻細胞的凈光合速率低于改良的Johnsons培養(yǎng)基中的，而呼吸速率沒有顯著地差異（P＞0.05），回流培養(yǎng)基藻細胞的葉綠素a與b的含量均小于改良的Johnsons培養(yǎng)基中的含量，但總類胡蘿卜素含量高于改良的Johnsons培養(yǎng)基中的含量。

表3 回流培養(yǎng)基與Johnsons培養(yǎng)基中杜氏鹽藻光合速率與色素含量Table 3 Photosynthetic rates,pigments contents ofDunaliella salina in fed-batch media and Johnsons media

3 結(jié)論

研究微藻培養(yǎng)中礦質(zhì)營養(yǎng)鹽的消耗速率對解析微藻細胞的礦質(zhì)營養(yǎng)機理與生產(chǎn)上的補料培養(yǎng)具有重要價值。杜氏鹽藻是少數(shù)幾種已經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)的經(jīng)濟藻種之一，產(chǎn)生的胡蘿卜素主要用于食品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域，現(xiàn)在全球年產(chǎn)大約1 200 t，仍存在巨大的市場空缺[11]。已有研究表明，營養(yǎng)缺乏對于杜氏鹽藻胡蘿卜素的積累具有關(guān)鍵作用[7，12]，因此研究各礦質(zhì)元素的消耗速率對于實現(xiàn)通過控制營養(yǎng)鹽的量偶聯(lián)光溫條件控制胡蘿卜素積累的時間與含量的目標具有重要的意義。研究鹽藻細胞對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的消耗速率相比于直接研究鹽藻細胞的礦質(zhì)元素組成具有明顯的優(yōu)勢，如可以避免細胞清洗過程中對表面吸附離子的丟失而導(dǎo)致的實驗誤差等[13]。本研究采用每增殖106個細胞消耗的離子量來表征杜氏鹽藻對金屬離子的消耗速率相比用單位時間消耗的離子量來表征消耗速率，可以規(guī)避不同培養(yǎng)條件下生長速率的不同而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)使用上的限制。鉀鎂離子為培養(yǎng)液中的大量元素，但杜氏鹽藻對于這兩種離子的利用量極低，超出了儀器的檢測限制。本研究結(jié)果表明，在細胞進入穩(wěn)定期后，杜氏鹽藻細胞仍在繼續(xù)吸收鐵、鈣離子，可能的原因是杜氏鹽藻細胞為生長條件的好轉(zhuǎn)做積累礦質(zhì)營養(yǎng)。在對硝酸根與磷酸根陰離子的研究中（未發(fā)表數(shù)據(jù)），在杜氏鹽藻細胞到達穩(wěn)定期后，培養(yǎng)液中硝酸根與磷酸根的含量不再降低，說明杜氏鹽藻細胞對鐵、鈣離子的利用上與對陰離子的利用方式存在不同。

鐵、鈣離子濃度限制型培養(yǎng)基中含有的鐵、鈣離子的量夠細胞長到細胞密度OD430nm2.0，但結(jié)果表明，鹽藻細胞密度最終達到OD430nm2.47，可能的原因是細胞鐵、鈣離子的儲存作用，與鹽藻細胞到達穩(wěn)定期后鐵、鈣離子的繼續(xù)降低數(shù)據(jù)相一致[14-15]。鹽藻細胞的光合活性與色素含量相應(yīng)減小說明鐵、鈣離子的濃度高低對藻細胞的光合作用系統(tǒng)有影響?；亓髋囵B(yǎng)基中藻細胞的延滯期消失說明回流培養(yǎng)基中的一些成分可以促使藻細胞對新培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)，但最終細胞密度沒有達到理論上的OD430nm2.0，說明回流培養(yǎng)液經(jīng)過多輪的利用后可能含有一些抑制細胞密度升高的成分。

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Effects of the fed-batch cultivation of mineral nutrients onDunaliella salinagrowth

Lü Hexin,JIA Shiru*,CUI Xianggan,XIA Feng
(Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

The consumption rate ofDunaliella salinaon iron,potassium,calcium and magnesium were determined by atomic absorption spectrum. The metal ion content limit type medium was established and the effect of adding metal ion onD.salinagrowth,photosynthetic rate and pigment content were studied.The results showed that the consumption of iron and calcium decreased linearly during the log growth phase.The consumption rates of iron and calcium in the medium were 0.042 μg and 0.708 μg for 106cell proliferation,and after stable phase,calcium,iron concentration continued to fall.However,the difference of potassium and magnesium concentration in the medium was not significant in the growth period.The feeding of iron and calcium ions could promote the growth ofD.salinacells to revive but with a lower photosynthetic rates and chlorophyll contents, the total carotenoid content was higher than logarithmic phase before feeding.After recycling adding limited iron and calcium to the medium in the stable phase,the cell lag phase disappeared but the cell concentration decreased in the stable phase.The photosynthetic rate and chlorophyll content of cell in log phase in backflow medium decreased,but the total carotenoid content increased inversely.

Dunaliella salina;β-carotene;metal ion;consumption rate;consumption kinetics

Q939.1

A

0254-5071（2014）11-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.011

2014-09-17

中國博士后科學(xué)基金（2014M561189）；長江學(xué)者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助（IRT1166）

呂和鑫（1980-），男，助理研究員，博士，研究方向為微藻生物工程。

*通訊作者：賈士儒（1954-），男，教授，博士，研究方向為生物反應(yīng)工程。